G四鏈體heminDNA酶的催化反應(yīng)的研究及應(yīng)用

G四鏈體heminDNA酶的催化反映的研究及應(yīng)用南開大學(xué)碩士學(xué)位論文G-四鏈體-heminDNA酶的催化反映的研究及應(yīng)用姓名：徐靜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：化學(xué)；分析化學(xué)指導(dǎo)教師：孔德明05摘要摘要摘要摘要G．四鏈體是DNA的二級(jí)構(gòu)造，能夠與氯化血紅素(heroin)結(jié)合形成含有過氧化氫酶活性的DNA模擬酶，稱之為G一四鏈體．heminDNA酶(簡(jiǎn)稱G．四鏈體DNA酶)。它能夠催化H202氧化ABTS(2，2，．氨基．二(3．乙基．苯并噻唑啉．6．磺酸))生成在波長(zhǎng)九=418n／n處有特性吸取的綠色產(chǎn)物ABTS一。本論文中結(jié)合此種DNA酶的特點(diǎn)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)ATP和H礦的新辦法：同時(shí)著重探討了ATP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶參加的催化反映的增進(jìn)作用。G．四鏈體-heminDNA酶應(yīng)用于ATP和H92+傳感器的設(shè)計(jì)：結(jié)合寡核苷酸鏈(5'-ACCTGGGGGAGTATTCJCGGAGG從GGT)是ATP的DNA適配體，可以與ATP特異性結(jié)合的事實(shí)，我們將特異性識(shí)別ATP的DNA適配體結(jié)合在富G序列的一端形成一條長(zhǎng)的核苷酸鏈；同樣根據(jù)H92+和胸腺嘧啶(T)能夠形成T_H92+_T的金屬堿基配對(duì)，使錯(cuò)配的T-T堿基更穩(wěn)定的事實(shí)，將通過T．T錯(cuò)配折疊成分子內(nèi)雙鏈的DNA序列插入富G序列中間也形成一條長(zhǎng)的核苷酸鏈(3：1拆分模式的G．四鏈體)。對(duì)應(yīng)地再設(shè)計(jì)另一條短鏈與長(zhǎng)的核苷酸鏈的部分互補(bǔ)。有效地運(yùn)用DNA／DNA雙鏈和DNA／目的物復(fù)合體之間的競(jìng)爭(zhēng)，即在沒有目的物(ATP或H92+)存在時(shí)，長(zhǎng)核苷酸鏈與短核苷酸鏈互補(bǔ)而破壞G．四鏈體的形成；在目的物存在下，ATP與適配體特異性結(jié)合或T_H92+．T金屬堿基配對(duì)有助于G．四鏈體的形成，同時(shí)促使含有催化活性的G．四鏈體-heroinDNA酶的形成，從而開發(fā)一種快速簡(jiǎn)便檢測(cè)ATP和H92+的新辦法。ATP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶參加的催化反映的影響：盡管G．四鏈體-heminDNA酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)，但有某些挑戰(zhàn)性的問題限制了其更遠(yuǎn)的發(fā)展和應(yīng)用，如：相對(duì)比較低的催化活性和反映產(chǎn)物ABTS一的歧化現(xiàn)象。本論文中證明了ATP對(duì)G．四鏈體-heroinDNA酶參加的催化反映的影響，成果表明ATP不僅能夠增加DNA酶的催化活性，也能夠克制ABTS一的歧化作用。這些發(fā)現(xiàn)可能會(huì)改善現(xiàn)存的基于G．四鏈體-heminDNA酶的化學(xué)生物傳感器的性能(如基于G．四鏈體．heroinDNA酶的Af檢測(cè))，擴(kuò)大G．四鏈體．heminDNA酶的應(yīng)用范疇，使ABTS成為裸眼檢測(cè)的抱負(fù)底物。另外實(shí)驗(yàn)證明了磷酸基團(tuán)、摘要核苷堿基和核糖三部分共同決定了ATP摘要核苷堿基和核糖三部分共同決定了ATP增進(jìn)反映的能力，這能夠協(xié)助人們?cè)O(shè)計(jì)更高效的G．四鏈體-heminDNA酶的增效因子。核心詞：G-四鏈體heminDNA酶ATPIa92+IIAbstractAbstractAbstractAbstractG--quadruplexesareuniquehigher-orderstructuresinwhichG·-richnucleicacidsequencesformstackedarraysofG—quartetsconnectedbyHoogsteen-typebasepairing．IthasbeenreportedthatsomeG—quadruplexescouldspecificallyandtightlybindtohemin，formingG—quadruplex·hemincomplexeswithperoxidase-likeactivity．ThesecomplexescanefficientlycatalyzeH202一mediatedoxidationreactions，suchastheoxidationof2,2'-azinobis(3一ethylbenzothiozoline)-6-sulfonicacid(ABTS)byH202intothecoloredproductABTS一，whichisaccompaniedbyallincreaseinabsorptionsignalat418nnl．Herein，asimple，colorimetricandselectiveng十a(chǎn)ndATPdetectionmethodbasedonG-quadruplex-hcrninDNAzymesisdeveloped．Furthermore，wedemonstratethepositiveeffectofadenosinetriphosphate(ATP)onG—quadruplex-heminDNAzyme-mediatedcatalyticreactions．InthisATPorH營(yíng)detectionmethod，twourdabelledoligonucleotideswithdifferentlengthareused，respectively．Forexample，intheATPdetectionmethod，觚label—-freelongoligonucleotidecontainingaG-richsegmentandATP··aptamersegment(5’·ACCTGGGGGAGT—JTGCGGAGGAAGGT，ontheonesideofG—richsegment)，andashortDNAstrand，whichiscomplimentarytoapartofthesequenceatthejunctionbetweenthetwosegmentsinthelongoligonucleotide，areused．Similarly,intheng+detectionmethod，theATP—aptamcrsegmentisreplacedbyaduplex-formingsequencecontainingthreecomplementarybasepairsseparatedbyfiveT-Tmismatches．Theduplex·formingsequenceisinsertedintotwoG矗chsequences．ThesetwostrategiestakeadvantagesofthecompetitionbetweenaDNA／DNAduplexandaDNA／targetcomplex，andtheformationofcatalyticallyactiveG-quadruplexesinthepresenceoftargets．ThisCanbereflectedbyallabsorbanceincreasewhenmonitoredintheH202·ABTSreactionsystembyusingUV-visabsorptionspectroscopy．Althoughthisclassofperoxidise-mimickingG—quadruplex-heminDNAzymeshasbeenwidelyusedinthedesignofchemicalsensors，somechallenges，forexample,IIIAbstracttheAbstracttherelativelylowcatalyticactivityandthedisproportionationofthereactionproductABTS一，mayseriouslyrestrictfUl伯"developmentandapplicationsoftheseDNAzymes．Here，wedemonstratethepositiveeffectofadenosinetriphosphate(ATP)onG—quadruplex-herninDNAzyme-mediatedcatalyticreactions．ThepresenceofATPnotonlyimprovesthecatalyticactivityofG—quadmplex·hem_inDNAzymes，butalsoinhibitsthedisproportionationofABTS一．TheseobservationsmaynotonlyimprovetheperformanceofexistingG—quadruplex-heminDNAzyme-basedchemicalsensors，forexample，theAg--detectionmethodthatBSesG-quadruplex-heminDNAzymes，butalsomakeABTSanidealsubstrateforvisualobservation,andwidentheapplicationrangeofG-quadruplex-heminDNAzymes．Besides，wealsodemonstratethatthephosphategroups，nucleobaseandsugarofATPdeterminethereaction-promotingabilityofATP．TheseobservationsmaybehelpfulinthedesignofhighlyeffieientenhancersforG—quadruplex-heminDNAzymes．Keywords：G-quadrupleheminDNAzymeATPHg+W1緒論l1緒論l 緒論生物分析化學(xué)作為分析化學(xué)與生命科學(xué)交叉過程中形成的一種新的學(xué)科分支，不同于典型分析化學(xué)，它以分析化學(xué)的理論為基礎(chǔ)，生物化學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的理論技術(shù)為輔助，物理學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)為手段，測(cè)量和獲取生物體內(nèi)的生物物質(zhì)的構(gòu)成、構(gòu)造、功效和多個(gè)有關(guān)信息。能夠提供生物體系中生物活性物質(zhì)的構(gòu)成、含量、構(gòu)造、形態(tài)等信息。隨著近幾十年生化分析的迅猛發(fā)展，其有關(guān)領(lǐng)域的研究重要集中在核酸分析、蛋白質(zhì)分析、生物小分子分析。在以上有關(guān)研究領(lǐng)域中，生物傳感器是一種新興的生化分析技術(shù)，其中G．四鏈體一heminDNA酶?jìng)鞲衅饕l(fā)了極大的關(guān)注。1．1G-四鏈體介紹常見的DNA是由兩條鏈通過Watson．Crick堿基配對(duì)形成的雙螺旋構(gòu)造。然而，富含鳥嘌呤G的重復(fù)DNA序列可形成四鏈螺旋構(gòu)造，被稱為G．四鏈體(G．quadmplex)。G．四鏈體的概念最早是在1962年由Gellert等學(xué)者提出來的【l捌。直到20世紀(jì)90年代，隨著G．四鏈體在體內(nèi)可能的生物學(xué)功效的發(fā)現(xiàn)，這一構(gòu)造才引發(fā)人們廣泛關(guān)注。大量研究表明，G．四鏈體DNA的出現(xiàn)與許多重要的生理過程緊密有關(guān)。在人體內(nèi)約有37萬可形成G．四鏈體的基因序列【31，其中在基因啟動(dòng)子區(qū)、端粒區(qū)等許多含有重要生物學(xué)功效的基因組中都存在富含鳥嘌呤的DNA序列，且許多序列在體外實(shí)驗(yàn)中已被證明能夠形成G．四鏈體構(gòu)造。另外人們也發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能夠與G．四鏈體結(jié)合的蛋白【4】，并且某些蛋白還能夠促使G．四鏈體構(gòu)造的形成【5】，這為G．四鏈體在體內(nèi)的存在提供了間接的證據(jù)。1991年Zalller課題組考察了不同折疊方式的端粒DNA作為引物對(duì)四膜蟲端粒酶活性的影響，成果發(fā)現(xiàn)：在K+存在的條件下能夠折疊成G．四鏈體構(gòu)造的端粒DNA不能作為端粒酶的引物，并克制了端粒酶對(duì)端粒的延伸從而克制了端粒酶的活性【6J。他們提出G．四鏈體構(gòu)造含有潛在的克制癌細(xì)胞擴(kuò)增的功效，這一發(fā)現(xiàn)促使G．四鏈體成為尋找端粒酶克制劑的新靶點(diǎn)，推動(dòng)了對(duì)G．四鏈體的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功效的研究。1緒論1．1．I1緒論1．1．IG．四鏈體的構(gòu)型富含鳥嘌呤(G)的DNA序列在特定離子強(qiáng)度下能夠折疊成G．四鏈體構(gòu)造。它是由堆積的G．四分體(G．quartet)平面構(gòu)成，并且每個(gè)G．四分體平面由在同一平面排列的四個(gè)鳥嘌呤通過Hoogsteen氫鍵構(gòu)成(圖1．1A)。即在G．四分體平面中鳥嘌呤G與G之間通過嘌呤環(huán)的7位N與2位N上的H和6位O與1位N上的H間形成的兩個(gè)氫鍵互相連接，G．四鏈體則借由G—quartet平面間的堿基的兀_兀堆積作用來穩(wěn)定存在(圖1．1B)。由于G．四分體平面的堆積，在中軸方向形成了一種極性的中央空腔，這個(gè)空腔可螯合適宜體積的陽離子(如K+，N礦)，通過鳥嘌呤的6位氧原子與陽離子發(fā)生配位作用，從而增強(qiáng)G．四鏈體構(gòu)造的穩(wěn)定性[741。GGGG G～掙‰夠 嘣¨堪頁r忡，凈～／N》N．．．^，之<～<從 G(A)G-quartet (B)G—quadruplex圖1．1 G·四分體平面(G-quartet)和G一四鏈體(G-quadruplex)G．四鏈體是多形態(tài)的，其構(gòu)型的多態(tài)性重要取決于核酸鏈的數(shù)目、鏈的走向和環(huán)的類型三個(gè)因素，根據(jù)形成G．四鏈體的核酸鏈數(shù)目的不同，G．四鏈體可以分為四分子G．四鏈體(圖1．2A)、雙分子G．四鏈體(圖1．2B～圖1．2E)及單分子G．四鏈體(圖1．2F～圖1．21)，構(gòu)成G．四鏈體構(gòu)造的持續(xù)G序列分別由4條、2條和1條獨(dú)立的核酸鏈所提供的【9‘1川；四分子G．四鏈體和雙分子G．四鏈體屬于分子間G．四鏈體，單分子G．四鏈體則屬于分子內(nèi)G．四鏈體。其中分子間G．四鏈體的形成速度相對(duì)較慢并且其穩(wěn)定性隨核苷酸鏈濃度的增加而增加；而分子內(nèi)G．四鏈體的穩(wěn)定性則不隨鏈的濃度發(fā)生變化【111。21 1 緒論四分子G．四鏈體中，4條鏈的走向存在3種組合方式：(1)4條鏈的走向都相似，這類G．四鏈體則為平行G．四鏈體；(2)2條鏈的走向相似，而與另外2條鏈的走向相反，這類G．四鏈體則為反平行G．四鏈體；(3)3條鏈的走向相似，而與另外1條鏈的走向相反，這類G．四鏈體則稱為混合類型的G．四鏈體【121。然而就現(xiàn)在報(bào)道的四分子G．四鏈體而言均以平行構(gòu)型存在，尚未發(fā)現(xiàn)有反平行或混合類型的四分子G．四鏈體。但對(duì)于雙分子G一四鏈體和單分子G．四鏈體，上述3種鏈的走向的組合方式都有可能出現(xiàn)。A ?。膱@4==刁 甲行 甲行 混介型■二J-。。。．．。|．1“∥c圄三p圃E@H國(guó)讞 僉制塒7A甲行k___—---——一●_———-·——_-一。’’?！??！?。'—一 I囤一度平行 反平{-圖1．2G．四鏈體構(gòu)型的多態(tài)性(箭頭代表的是鏈的5’到3’走向)G．四鏈體中連接持續(xù)G序列的核苷酸序列構(gòu)成了G．四鏈體的環(huán)，其中存在2種重要類型的環(huán)：末端環(huán)(terminalloop)和鏈反轉(zhuǎn)環(huán)(chainreversalloop)[12】。末端環(huán)位于G．四鏈體構(gòu)造的上下兩端，且連接的兩個(gè)G堿基位于同一G．四分體平面上，同時(shí)末端環(huán)又可分為側(cè)環(huán)(1ateralloop)和對(duì)角環(huán)(diagonalloop)，側(cè)環(huán)連接的兩個(gè)G堿基可位于G．四分體的一條邊上(見圖1．2C和圖1．2D)，而對(duì)角環(huán)連接的兩個(gè)G堿基則位于G．四分體的對(duì)角線上(見圖1．2E)。鏈反轉(zhuǎn)環(huán)位于G．四鏈體構(gòu)造的側(cè)面，且連接的兩個(gè)G堿基分別位于G．四鏈體上下兩端的兩個(gè)G-四分體平面上(見圖1．2B和圖1．2F)。環(huán)類型的不同也可對(duì)G．四鏈體構(gòu)型產(chǎn)生一定影響，如反平行的單分子G．四鏈體可根據(jù)末端環(huán)類型的不同能夠分為椅式構(gòu)型(圖1．2H)和提籃式構(gòu)型(圖1．2I)。1．1．2 G．四鏈體的特點(diǎn)與DNA雙螺旋構(gòu)造相比，G．四鏈體構(gòu)造有兩個(gè)明顯的特點(diǎn)。其一是它的穩(wěn)l緒論定性決定于口袋內(nèi)所結(jié)合的陽離子類型【l孓”l；陽離子對(duì)G．四鏈體的形成及穩(wěn)定l緒論定性決定于口袋內(nèi)所結(jié)合的陽離子類型【l孓”l；陽離子對(duì)G．四鏈體的形成及穩(wěn)定性有明顯的增進(jìn)作用，在有關(guān)陽離子與G．四鏈體的互相作用的研究中，研究最多的是一價(jià)陽離子，單價(jià)離子穩(wěn)定G．四鏈體螺旋DNA的作用大小為：l

NH4+>Na◆Cs+>Li+，其中以K+、N礦、NH4+的研究為主。K+對(duì)四鏈體的穩(wěn)定能力最強(qiáng)，Na+最弱，而NH4+IIJ介于兩者之間【l61。究其因素可能與陽離子的半徑大小有關(guān)聯(lián)，K+的半徑較大能夠進(jìn)入到相鄰的兩個(gè)G．四分體平面中間，并且與兩個(gè)G．四分體平面上的8個(gè)羰基氧原子結(jié)合，從而極大地增加了G．四分體堆積的穩(wěn)定性【171；而Na+半徑較小能夠直接進(jìn)入到某一G一四分體平面內(nèi)部【16l，因此無法起到類似K+連接兩個(gè)G．四分體平面的作用。然而不同的陽離子也會(huì)在一定程度上影響G．四鏈體的構(gòu)型，對(duì)某些富G的寡核苷酸鏈，在Na-存在下形成反平行G．四鏈體而在K+存在下則形成平行G．四鏈體【l引，其中一種因素可能是當(dāng)Na+進(jìn)入到末端的G．四分體平面內(nèi)后可與末端環(huán)上的堿基發(fā)生互相作用而對(duì)反平行G．四鏈體起到額外的穩(wěn)定作用【161。N吖對(duì)G．四鏈體構(gòu)型的影響則介于兩者之間。同時(shí)某些二價(jià)陽離子如Pb2+、Ba2+、Sr2+和Mn2+等也含有增進(jìn)G．四鏈體生成的作用【13'19。221，特別是Pb2+，它對(duì)G．四鏈體的穩(wěn)定能力甚至強(qiáng)于K+t14,25】。pb2+的離子半徑與K+相近只比K+略小，與K+同樣也是進(jìn)入到兩個(gè)G．四分體平面的中央并且與兩個(gè)G．四分體上的8個(gè)羰基氧原子結(jié)合【2弛71，但pb2+存在下的G．四鏈體的㈨鍵(M代表金屬)、㈣鍵以及兩個(gè)G．四分體平面之間的垂直距離都要短于K_存在下的狀況【25，271，即Pb2+存在下G．四鏈體的構(gòu)型更為緊密，所以穩(wěn)定性就更高。G．四鏈體螺旋DNA的另一特點(diǎn)是在熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)上都很穩(wěn)赳28．301。例如在含K+的溶液中，d(TTCKTK3G)4在90℃仍可穩(wěn)定存在。對(duì)于d(TTGGGG)形成的平行四鏈體螺旋構(gòu)造的熱力學(xué)計(jì)算顯示，在K+存在的狀況下，25℃時(shí)的AGo為-47kcaVmol。另外G．四鏈體螺旋DNA的折疊和解鏈速度非常慢，對(duì)纖毛原生動(dòng)物端粒結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)顯示，d(TTGGGG)4在K+溶液中的解鏈速度是10。5s．1，折疊速度是O．02S一。因此在測(cè)定端粒DNA的熱力學(xué)參數(shù)特別是溫度變性實(shí)驗(yàn)中，研究者必須要有足夠的時(shí)間使反映達(dá)成平衡，這樣才干獲得較精確的成果。1．1．3研究G．四鏈體構(gòu)造的辦法由于G．四鏈體構(gòu)造的多樣性，揭示G．四鏈體的構(gòu)造對(duì)其應(yīng)用有著十分重要41緒論的意義。1緒論的意義。現(xiàn)在多個(gè)技術(shù)如圓二色光譜法(CD)、核磁共振技術(shù)(NMR)、紫外一可見光譜(UV-visspectroscopy)、熒光光譜(fluorescencespectroscopy)、X-單晶衍射(X-raydiffraction)、質(zhì)譜(massspeetrometry)、凝膠電泳(gelelectrophoresis)等已被廣泛地用來研究G．四鏈體的形成及性質(zhì)。其中最常見的G．四鏈體構(gòu)造分析的辦法以下：(1)圓二色光譜分析(CD)圓二色光譜是一種特殊的吸取光譜，他對(duì)手性分子的構(gòu)象十分敏感，此種光譜法不僅能判斷G．四鏈體與否形成，并且還能分辨G．四鏈體的平行構(gòu)造和反平行構(gòu)造【31‘331。光譜圖上在210nln附近有一正峰則表明G一四鏈體構(gòu)造的形成【10】；在260am附近有一正峰且240hill附近有一負(fù)峰則表明平行(parallel)G．四鏈體構(gòu)造的形成；在295am附近存在一種正峰且260nln附近存在一種負(fù)峰則表明反平行(antiparallel)G．四鏈體構(gòu)造的形成；在268hill和295姍處都有正峰則表明混合(mixed．hybrid)G一四鏈體構(gòu)造的形成【31弓21。(2)核磁共振光譜分析(NMR)現(xiàn)在用二維核磁共振技術(shù)加上計(jì)算機(jī)模擬已能獨(dú)立擬定小蛋白質(zhì)分子及核苷酸片段在溶液中的三維空間構(gòu)造，．同時(shí)也可用來研究構(gòu)象的變化。因而核磁共振光譜能提供溶液中G．四鏈體構(gòu)造的重要信息。用核磁共振技術(shù)，樣品制備比較簡(jiǎn)樸，但是純度規(guī)定比較高。含有G．四分體的物質(zhì)在核磁譜圖上會(huì)出現(xiàn)亞胺基上的質(zhì)子峰，化學(xué)位移在10．5．12．0ppm之間。總之核磁共振二維核奧弗豪澤增強(qiáng)譜NOESY光譜上若出現(xiàn)亞胺基特性峰(10．5．12．0ppm)和G．a(chǎn)mino與GH8交叉峰表明G一四鏈體構(gòu)造的形成。另PbG．四鏈體構(gòu)造中鍵合的亞胺基質(zhì)子與D20的作用比非鍵合的質(zhì)子要慢得多，多位核磁技術(shù)被用來論述更精確的構(gòu)造【3"61。(3)紫外可見光譜分析(Uv)對(duì)于某一富含鳥嘌呤G的寡核苷酸鏈，當(dāng)其未形成G。四鏈體構(gòu)造時(shí)在波長(zhǎng)260hill處有對(duì)應(yīng)的吸光信號(hào)，當(dāng)其形成G．四鏈體構(gòu)造時(shí)在波長(zhǎng)295ii／n處有相應(yīng)的吸光信號(hào)。也就是說，當(dāng)G．四鏈體構(gòu)造隨著溫度的升高遭到破壞時(shí)，260nln處的吸光度會(huì)對(duì)應(yīng)地升高，在295nnl處的吸光度會(huì)對(duì)應(yīng)地減少，即DNA在紫外區(qū)260nnl呈現(xiàn)增色效應(yīng)，在295hill處呈現(xiàn)減色效應(yīng)。通過升溫和降溫繪制0．95℃溫度范疇內(nèi)紫外吸取與溫度的變化曲線，該曲線的一階導(dǎo)數(shù)的最大值處所對(duì)應(yīng)的溫度即為G．四鏈體構(gòu)造的解鏈溫度值(meltingtemperature，％)【37】。由此發(fā)現(xiàn)在100mMNaCl和KCl溶液中，在260nlTl處的解鏈溫度都是70℃士2℃；51 1 緒論而在295nln處兩者的解鏈溫度是不同的，C溶液中的％為67℃士3℃，高于Na+溶液中的％(50℃士1℃)。闡明DNA的端粒在N礦和K+溶液中存在兩種不同的構(gòu)造。這兩種不同的G．四鏈體構(gòu)造含有構(gòu)造有關(guān)性，其構(gòu)造的變化依賴于離子濃度和G．寡核苷酸(G．ODN)濃度的變化。該辦法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要對(duì)形成G．四鏈體的寡核苷酸鏈進(jìn)行任何的修飾，對(duì)儀器的規(guī)定也比較簡(jiǎn)樸，只需一臺(tái)配有控溫裝置的紫外．可見分光光度計(jì)即可。但在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的信號(hào)變化相對(duì)較小。(4)熒光光譜分析(fluorescencespectroscopy)熒光光譜特別是能量轉(zhuǎn)移光譜(Fl遼T)因其高敏捷性和多維性成為一種有效的研究G．四鏈體構(gòu)造辦法。運(yùn)用多個(gè)熒光參數(shù)如強(qiáng)度(intensity)、壽命(1ifetime)、各向異性(anisotropy)、光譜(spectra)和能量轉(zhuǎn)移光譜(fluorescenceresonanceenergytransfer)，我們不僅能夠描述分子構(gòu)造并且還能夠獲得濃度(eoneentration)、內(nèi)部鏈移動(dòng)(interstrandmotion)、鍵合事件(bindingevents)(等信息。DNA分子本身常溫下不發(fā)射熒光，但是可將DNA鏈進(jìn)行熒光修飾從而觀察DNA構(gòu)型的變化【38枷】。另外某些蛋白質(zhì)和小配體也可識(shí)別特殊的G．四鏈體構(gòu)造【9,42-45】。有些本身熒光較低的金屬配合物與核酸作用后，因熒光猝滅受到克制而使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；而有些本身有熒光的分子與核酸作用后，會(huì)產(chǎn)生熒光猝滅而使熒光強(qiáng)度削弱。運(yùn)用這些現(xiàn)象可進(jìn)行動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)分析。FRET辦法能夠提供溶液中分子距離信息，因而很適合研究核苷酸和蛋白質(zhì)構(gòu)造變化，同時(shí)由于折疊構(gòu)造和未折疊構(gòu)造的熒光性質(zhì)存在很大的不同，因此FRET辦法已被廣泛地應(yīng)用于研究G．四鏈體構(gòu)造特別是其構(gòu)造的熱力學(xué)【4“引。(5)X．單晶衍射分析(X．raydiffraction)X．單晶衍射由于含有高分辨率而成為一種研究G．四鏈體構(gòu)造的強(qiáng)大辦法。X．單晶衍射不僅能夠檢測(cè)構(gòu)造重組，并且還能夠明確G．四鏈體核心骨架和多變的環(huán)構(gòu)造。這種辦法的缺點(diǎn)是只對(duì)固態(tài)構(gòu)造進(jìn)行研究，然而固態(tài)下的構(gòu)造并不一定與溶液中的構(gòu)造相似。另外獲得可靠的單晶也不是一件易事【49】。(6)聚丙酰胺凝膠電泳分析(gelelectrophoresis)聚丙酰胺凝膠電泳用于分離不同物理性質(zhì)(如大小，形狀，等電點(diǎn)等)的分子。通過觀察不同構(gòu)型的DNA的流動(dòng)性從而判斷G．四鏈體與否形成，以及區(qū)別分子內(nèi)G．四鏈體與分子間G．四鏈體【33，501。聚丙烯酰胺凝膠電泳的遷移速率主要取決于分子所帶的凈電荷以及分子的大小和形狀等因素，分子間G．四鏈體移61緒論動(dòng)速度比較慢，而分子內(nèi)G．四鏈體移動(dòng)速度相對(duì)快點(diǎn)【5l】。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，1緒論動(dòng)速度比較慢，而分子內(nèi)G．四鏈體移動(dòng)速度相對(duì)快點(diǎn)【5l】。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，也是一種研究核苷酸構(gòu)造的簡(jiǎn)便辦法，但缺點(diǎn)是不能分辨分子量相似的不同拓?fù)錁?gòu)造的四鏈體。1．2G．四鏈體．heminDNA酶介紹酶是含有催化功效的生物大分子，含有高度的底物專一性和很高的催化效率。長(zhǎng)久以來人們始終認(rèn)為酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，但1982年Cech等[543發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物四膜蟲的RNA含有自我剪切功效，接著1983年Altmann等人【55】發(fā)現(xiàn)RNA能夠切割RNA，這些發(fā)現(xiàn)證明了核酸RNA也含有酶的催化效應(yīng)，提出了核酶的概念。同時(shí)這個(gè)發(fā)現(xiàn)變化了“生物體內(nèi)全部的酶都是蛋白質(zhì)"的傳統(tǒng)觀念。1994年Breakel"和Joyce[56J運(yùn)用“催化洗脫哆(catalyticelution)的辦法，從約1014條不同序列的DNA分子庫(kù)中初次分離得到了依賴二價(jià)金屬離子的能夠切割RNA的單鏈DNA分子，這些含有酶催化功效的DNA分子稱為脫氧核酶(deoxyribozymes或DNAzymes)，又稱DNA酶。也就是說，DNA酶(DNAzyme)是含有催化活性的DNA分子【571。其中G．四鏈體-heminDNA酶則是近些年來迅速發(fā)展起來的一類新興DNA酶，自從1998年Travascio等人報(bào)道某些G-四鏈體與hemin結(jié)合后能夠顯示出較強(qiáng)的過氧化物酶活性以來【581，G．四鏈體．heroinDNA酶的研究就開始逐步引發(fā)了人們的愛好。特別是近幾年，有關(guān)該類DNA酶的多個(gè)研究獲得了迅猛的發(fā)展。1．2．1G．四鏈體．heminDNA酶的特點(diǎn)G．四鏈體-heminDNA酶是由一段能形成G．四鏈體的DNA序列與hemin結(jié)合的含有過氧化物酶活性的復(fù)合物，也稱之為DNA過氧化物酶。G．四鏈體-heminDNA酶的DNA片段首先能夠形成G．四鏈體，K+位于兩個(gè)G．四分體平面的中間，與8個(gè)鳥嘌呤G的6位氧原子形成八配位穩(wěn)定G．四鏈體；然后hemin作為平面型分子，中心的鐵離子與卟啉環(huán)的4個(gè)氮原子發(fā)生配位作用，在heroin和G．四分體平面靠近時(shí)，G一四分體平面的大共軛體系與Fe離子發(fā)生配位作用，形成了hemin．DNA復(fù)合物【591。作為一類重要的人工酶，G．四鏈體．heroinDNA酶除了含有人工酶所含有的71緒論價(jià)廉、水解穩(wěn)定性好、易于制備、合成、標(biāo)記及熱穩(wěn)定性好等一系列優(yōu)勢(shì)以外，1緒論價(jià)廉、水解穩(wěn)定性好、易于制備、合成、標(biāo)記及熱穩(wěn)定性好等一系列優(yōu)勢(shì)以外，本身還含有一種非常重要的特點(diǎn)即含有較強(qiáng)的拆分能力。G．四鏈體構(gòu)造的形成最少需要有四組持續(xù)的G序列，形成G．四鏈體的富G序列既能夠整體存在，也能夠拆分成兩部分，甚至還能夠拆分成四部分。以拆分成兩部分為例，能夠采取2：2(分成的兩部分分別含有兩組持續(xù)G序列)或3：1(分成的兩部分分別含有三組和一組持續(xù)G序列)兩種拆分模式160“¨。這樣在G．四鏈體．heminDNA酶類傳感器的設(shè)計(jì)當(dāng)中，既能夠把靶向特異性的探針序列連接在G．四鏈體形成序列的·端，也能夠插入到G．四鏈體形成序列的中間。既能夠運(yùn)用探針與靶作用時(shí)所引發(fā)的DNA二級(jí)構(gòu)造的變化增進(jìn)G．四鏈體的生成或破壞原有的G．四鏈體【62舶】，也能夠采用適宜方法使探針與靶結(jié)合后延伸出適宜的富G序列增進(jìn)G．四鏈體的生成【67】，或延伸出適宜的富C序列來破壞原有的G．四鏈體。上述特點(diǎn)為G．四鏈體．heminDNA酶類傳感器的設(shè)計(jì)提供了多個(gè)選擇途徑。然而與天然酶相比，人工酶在催化活性方面仍存在有很大的差距，同樣G一四鏈體．heminDNA酶的催化活性就遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于辣根過氧化酬傭-69]。1．2．2不同構(gòu)型G．四鏈體．heroinDNA酶的催化效果研究發(fā)現(xiàn)G．四鏈體的構(gòu)型是多個(gè)多樣的，并且不同構(gòu)型的G．四鏈體和hemin結(jié)合后催化作用也大不相似，如人類的某些基因區(qū)易形成分子內(nèi)平行構(gòu)造的G．四鏈體，如VEGF、c．Myc、EAD、EAD2、EAD3和RET．結(jié)合heroin后顯示出很強(qiáng)的催化效應(yīng)；然而另外某些富含G堿基的DNA片段容易折疊成分子內(nèi)反平行結(jié)構(gòu)的G．四鏈體，如TA、TA2、HT和Oxy28。和hemin結(jié)合后顯示出很弱的催化效應(yīng)；尚有分子間的G．四鏈體如(36、G8等和hemin結(jié)合后的催化效果也很弱【．701；而平行和反平行共存的混合構(gòu)造的G．四鏈體如Bcl．2、PS2．M和EAD4結(jié)合heroin后體現(xiàn)出較強(qiáng)的過氧化氫酶活性?？傊煌瑯?gòu)型的G．四鏈體和heroin結(jié)合后形成的DNA酶呈現(xiàn)出不同的催化活性，因此G．四鏈體構(gòu)造與催化效果之間的關(guān)系成為許多課題組研究的對(duì)象。近年來Cheng等【_71】探究了G．四鏈體拓?fù)錁?gòu)造與催化能力之間的關(guān)系。如圖1．3A和1．3B所示，分子內(nèi)G．四鏈體的形成需要三個(gè)環(huán)連接G．四分體，其中平行G．四鏈體構(gòu)造(如圖1．3A)的環(huán)部以螺旋的構(gòu)造連接鄰近的兩條平行鏈【72】，即將頭部和底部的G．四分體連接起來，此時(shí)三個(gè)環(huán)都分布在G．四鏈體的側(cè)面上；81緒論而反平行G．四鏈體1緒論而反平行G．四鏈體構(gòu)造(如圖1．3B)的環(huán)部連接了兩對(duì)鄰近的反平行鏈和一對(duì)對(duì)角線上反平行鏈ll剮，三個(gè)環(huán)就遮蔽了底部和頭部的兩個(gè)G．四分體平面。據(jù)報(bào)道許多小分子和G．四鏈體的結(jié)合都是小分子緊密堆積在G．四鏈體末端的兩個(gè)平面上【『741引，因此環(huán)位于側(cè)面上的平行G．四鏈體更容易和小分子采用末端堆積，即結(jié)合hemin形成的G．四鏈體配合物有很強(qiáng)的催化能力。這正是平行G．四鏈體催化能力更強(qiáng)的因素所在。然而反平行G．四鏈體由于環(huán)部遮蔽了兩個(gè)G．四分體平面，較強(qiáng)的位阻效應(yīng)使hemin不易與G．四鏈體中的鳥嘌呤G結(jié)合，因此反平行G．四鏈體的催化能力較弱。同樣四鏈的分子間G．四鏈體也是由于末端的T4對(duì)heroin的結(jié)合有較強(qiáng)的位阻效應(yīng)(如圖1．3C所示)，因此分子間G．四鏈體的催化能力也較弱。向囤———■●●rA B C圖1．3不用構(gòu)型G．四鏈體與heroin結(jié)合示意圖：(A)分子內(nèi)平行G．四鏈體．hemin配合物，(B)分子內(nèi)反平行G．四鏈體-hemin配合物，(C)四鏈的分子間G．四鏈體．hemin配合物。1．2．3 G．四鏈體．heminDNA酶的在傳感器設(shè)計(jì)中的應(yīng)用近年來有關(guān)G．四鏈體．heminDNA酶的研究越來越受到人們的普遍關(guān)注。在該類DNA酶的基礎(chǔ)上，已開發(fā)了一系列的高敏捷度、高特異性的化學(xué)及生物傳感器。(1)金屬離子傳感器近年來，人們?cè)趯．四鏈體．heminDNA酶用于金屬離子定量檢測(cè)方面，設(shè)計(jì)了幾個(gè)高敏捷度、高特異性的定量檢測(cè)辦法，如應(yīng)用于檢測(cè)K+【38，65,份94]、Pb2+【8“871、H92+【“，88-901、Ag+【63，66，911、Cu2+192】等。其中董紹俊課題組運(yùn)用Ag+n-]"與兩個(gè)胞嘧啶堿基(C)相結(jié)合生成C．Ag+．C堿基對(duì)的這一性質(zhì)【931，設(shè)計(jì)了一種超敏捷的A。+，'-一一一--檢測(cè)辦法【911。91緒論ABTS1緒論ABTSd炒_姐Ts”Ag+——cyscomplex+艇：：套一蠆T0'■·=Ag+，磚辛：：：：：：志彳 一 ；；二{；墮A脅槌vT．下 Hem紐車 ．℃¨補(bǔ)甜托引怊G．A．p、A 車_o：：牟下T 巨薹 A段麟肼#下f王A，占0、下f下午T 匙辮斯鏟奉S2．A車c．A鏈I 鏈2 ”Tnm_on“ 一Tum胡”鏈1：$'-TCTCTGTGGAGGG 鏈2：$'-ACACAGC撼ACGGG圖1．4G．四鏈體-heminDNA酶用于Ag+定量檢測(cè)的原理示意副91】鄉(xiāng)～3●；mm／’、j-。mmm鏈4 尋廠、鏈3：S·．ACAGGCGGCCTTAACTGTAGTTGGGTAGGGCGGG鏈4：5-一TGGGTCTGGTGAAATTGCTGCC靶I：5'-GGCAGCAATI'rCACCAGTACTACAGTTAAGGCCGCCTGT圖1．5G一四鏈體-heminDNA酶用于DNA均相檢測(cè)的原理示意剛刪如圖1．4所示，在此種G．四鏈體-heminDNA酶檢測(cè)A礦辦法中，使用了兩條寡核苷酸鏈(圖1．4，鏈1和鏈2)，兩條寡核苷酸鏈的3’．端都是富G序列且各包含兩組持續(xù)G序列，它們可互相作用而形成分子間雙分子G．四鏈體。同時(shí)在該G．四鏈體構(gòu)造中兩條寡核苷酸鏈的5’．端延伸出的序列能夠互相結(jié)合形成分子間二倍體，但是由于C．C堿基錯(cuò)配的存在該二倍體并不可能穩(wěn)定存在。這時(shí)我們可借助Ag+對(duì)c．c堿基錯(cuò)配的穩(wěn)定能力以增進(jìn)二倍體的形成，從而二倍體的形成也可進(jìn)一步增加G．四鏈體的穩(wěn)定性，進(jìn)而增加G．四鏈體與hcmin結(jié)合后的酶活性。運(yùn)用此辦法進(jìn)行Ar的定量檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)成2．5nM。另外該方法還可進(jìn)一步開發(fā)用于半胱氨酸的定量檢測(cè)。運(yùn)用含巰基的半胱氨酸能夠與A礦發(fā)生強(qiáng)烈的互相作用而將A礦從c．A，．c堿基對(duì)上取代下來，從而又減少了上述101緒論二倍體1緒論二倍體構(gòu)造的穩(wěn)定性，使得體系的催化活性減少。運(yùn)用此辦法即可進(jìn)行半胱氨酸的定量檢測(cè)，其檢測(cè)限能夠達(dá)成40nM。(2)DNA傳感器DNA的序列特異性檢測(cè)也是G．四鏈體-heroinDNA酶的一種重要應(yīng)用，人們?cè)诖朔矫孢M(jìn)行了大量的探索性研究，設(shè)計(jì)了多個(gè)各樣的DNA傳感器。根據(jù)檢測(cè)模式的不同，我們將這些傳感器大致可分為均相和非均相兩種。其中在運(yùn)用G．四鏈體-heminDNA酶進(jìn)行均相DNA傳感器的設(shè)計(jì)中，大多使用了裂分的G．四鏈體，即將能夠形成G．四鏈體的富G序列分成了3：1(分成的兩部分分別含有三組和一組持續(xù)G序列)或2：2的兩部分(分成的兩部分分別含有兩組持續(xù)G序列)[60-611。如圖1．5所示，周翔課題組報(bào)道的裂分G．四鏈體檢測(cè)DNA的辦法中，將可形成G一四鏈體的富G序列分成了3：1的兩部分，這兩部分分別連接在兩條寡核苷酸探針鏈(如圖1．5，鏈3和鏈4)的3’．端和5’．端。在靶基因(靶1)的存在下，兩條探針鏈在相鄰的位點(diǎn)與靶基因發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)合作用所造成的結(jié)果是使兩部分富G序列互相靠近和互相締合而形成裂分G一四鏈體，和hemin結(jié)合顯示出較強(qiáng)的酶活性。借此能夠進(jìn)行靶基因的特異性檢測(cè)。將此技術(shù)與不對(duì)稱PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒从?擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用，Mahesh課題構(gòu)成功地實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌(Salmonella)及分支桿菌(Mycobacterium)的裸眼檢測(cè)【舛1。借助于探針序列與靶基因的特異性結(jié)合作用，此辦法還可用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)[60-611。周翔課題組也證明了當(dāng)使用此種3：1裂分的G．四鏈體時(shí)，可檢測(cè)出正?；蛑?％突變基因的存在【鯽。(3)酶?jìng)鞲衅鞫肆Ｃ甘且环N專一性的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以本身的RNA亞單位為模板在蛋白亞單位逆轉(zhuǎn)錄酶的推動(dòng)作用下，催化合成染色體末端的端粒，維持其端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，可使細(xì)胞得以永生。研究發(fā)現(xiàn)在人類85％以上的惡性腫瘤中都能夠檢測(cè)到端粒酶的活性【951，也就是說端粒酶的活性分析可望用于癌癥的早期診療以及惡性程度判斷【961。根據(jù)端粒酶引物在活性端粒酶作用下可延伸出5'-TTAGGG重復(fù)序列的特點(diǎn)，Willner研究小組設(shè)計(jì)了一種基于G．四鏈體-heminDNA酶的端粒酶?jìng)鞲衅鳌?”。該傳感器的設(shè)計(jì)中使用的探針鏈重要由四部分構(gòu)成，從5·．端到3’．端依次為：能夠形成G．四鏈體的富G序列(I)、與端粒酶延伸產(chǎn)物互補(bǔ)的探針序列(II)、1緒論與I部分序列互補(bǔ)的序列(III))以及端粒酶引物序列(Ⅳ)。由于III與I的部1緒論與I部分序列互補(bǔ)的序列(III))以及端粒酶引物序列(Ⅳ)。由于III與I的部分序列互補(bǔ)，兩者能夠互相結(jié)合使探針鏈本身折疊成一種分子內(nèi)的發(fā)夾構(gòu)造，其中部分富G序列被包埋在該發(fā)夾構(gòu)造當(dāng)中從而不能形成G．四鏈體，因而體系無催化活性。然而在活性端粒酶的作用下，探針3’．端的引物序列(Ⅳ)延伸出5’．T1’AGGG的重復(fù)序列。由于該重復(fù)序列與鏈上的探針序列(II)完全互補(bǔ)，兩者能夠互相結(jié)合形成一種新的更為穩(wěn)定的分子內(nèi)發(fā)夾構(gòu)造。因此原有的發(fā)夾構(gòu)造遭到破壞，富G序列被釋放出來，釋放出來的富G序列則折疊形成G．四鏈體，與heroin結(jié)合后顯示過氧化物酶的活性。運(yùn)用此辦法可檢測(cè)出500個(gè)癌細(xì)胞中的端粒酶的活性。(4)藥品傳感器G．四鏈體的研究之因此能夠很快地引發(fā)人們的普遍關(guān)注，是由于在人類染色體的末端存在一段單鏈富G端粒序列。在諸多惡性腫瘤當(dāng)中，由于這段單鏈的端粒序列能夠被端粒酶所延伸而避免在細(xì)胞分裂過程中程序性縮短，使細(xì)胞得以永生。研究也發(fā)現(xiàn)富G的端粒序列能夠形成G．四鏈體構(gòu)造【341，并且一旦形成G．四鏈體就不能再被端粒酶所延伸【9引。因此能夠增進(jìn)端粒區(qū)域形成G．四鏈體構(gòu)造并對(duì)該構(gòu)造起到穩(wěn)定作用的藥品有望被開發(fā)成為一類新型的抗癌藥品。在G．四鏈體的穩(wěn)定劑類抗癌藥品的開發(fā)過程中，非常有必要建立一種簡(jiǎn)便快速的藥品大批量篩選辦法?？紤]到hew_in可與G。四鏈體結(jié)合而顯示出較強(qiáng)的酶活性，G．四鏈體的穩(wěn)定劑也需要與G．四鏈體結(jié)合而對(duì)此構(gòu)造起到穩(wěn)定作用。若兩者在G．四鏈體上的結(jié)合位點(diǎn)相似或相靠近，G．四鏈體穩(wěn)定劑在G．四鏈體上的結(jié)合則有可能有效地妨礙heroin與G．四鏈體的結(jié)合作用，造成體系的催化活性減少。當(dāng)ABTS作為催化反映的底物時(shí)，在G．四鏈體．heminDNA酶的催化下，ABTS可被H202氧化成自由基ABTS一，造成反映體系在特定波長(zhǎng)下的吸光度值增加，并且體系呈現(xiàn)出特性的綠色。當(dāng)向G．四鏈體和hemin的混合體系中加入帶篩選藥品，若加入的藥品能夠與G．四鏈體作用則藥品與G．四鏈體的結(jié)合作用會(huì)使hemin與G．四鏈體的結(jié)合作用削弱，從而體系的酶活性減少，最后造成反映體系的顏色削弱甚至消失；然而當(dāng)待篩選藥品不與G．四鏈體互相作用時(shí)，它的加入就不會(huì)對(duì)hemin與G一四鏈體的結(jié)合作用產(chǎn)生明顯的影響，反映體系的顏色基本上也不變，仍保持特性的綠色。借此即可實(shí)現(xiàn)G．四鏈體穩(wěn)定劑類抗癌藥品的大批量篩選【9引。該辦法的優(yōu)點(diǎn)在于：操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)抗癌藥品的大批量篩選；篩選成果能夠用裸眼鑒定，消除了對(duì)儀器的依賴性；試劑用量少，價(jià)廉，使用121 1 緒論的G一四鏈體DNA不需要進(jìn)行任何標(biāo)記，反映溶液的總體積為100肛L甚至更低。1．3核酸適配體介紹過去幾十年抗體技術(shù)的快速發(fā)展對(duì)醫(yī)學(xué)及整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展做出了巨大奉獻(xiàn)。但是自從1990年美國(guó)科學(xué)家Tuerk[100]和Ellington[101】分別從約1015種寡核苷酸分子庫(kù)中篩選出RNA型寡核苷酸適配體以來，抗體技術(shù)受到前所未有的挑戰(zhàn)。寡核苷酸適配體不僅能和抗體同樣能與配體高效、專一地結(jié)合，并且有著許多抗體無法比擬的地方，如配體廣泛、無免疫原性、分子量小、可修飾和體外篩選等優(yōu)點(diǎn)。寡核苷酸適配體與配體特異性識(shí)別，為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供了一種高效快速的分析檢測(cè)研究平臺(tái)，極大地?cái)U(kuò)展了核酸的應(yīng)用【1眙1031。1．3．1 核酸適配體的概念及SELEX技術(shù)原理核酸適配體是可與靶物質(zhì)分子高特異性、高親合力結(jié)合的單鏈DNA或RNA序列，它能夠通過體外篩選過程進(jìn)行合成，即通過所謂的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SELEX)篩選出來的，能與對(duì)應(yīng)配體專一性緊密結(jié)合的一類單鏈DNA或RNA寡核苷酸序列。普通由幾十個(gè)核苷酸(20．60nt)構(gòu)成，稱為aptamer。Aptamer源于拉丁語aptus，即適合之意。也稱為核酸適體、適配體、適配子等。1990年，Tuerk和Gold初次運(yùn)用SELEX技術(shù)成功篩選到噬菌體T4DNA聚合酶的RNA型適配體，并將其用于研究小分子核酸與靶物質(zhì)相結(jié)合【l卿，他們對(duì)SELEX技術(shù)的研究開啟核酸適體研究的新時(shí)代；Ellington和Szostak運(yùn)用此技術(shù)與PCR擴(kuò)增相結(jié)合，從構(gòu)建的隨機(jī)RNA文庫(kù)中篩選到能特異性結(jié)合小分子有機(jī)染料的寡核苷酬1011。SELEX技術(shù)原理是運(yùn)用大容量的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子的互相作用形成靶物質(zhì)／核酸的復(fù)合物：分離復(fù)合物并洗脫與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸，即從中篩選出與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸；接下來結(jié)合PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，以此核酸序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增使其得到指數(shù)級(jí)富集，得到下輪篩選的次級(jí)文庫(kù)；通過數(shù)輪重復(fù)篩選與擴(kuò)增，最后可獲得與配體高特異性、高親和力結(jié)合的核酸適配體(如圖1．6)。適配體純化循環(huán)的次數(shù)取決于每一次循環(huán)的嚴(yán)謹(jǐn)程度。普通而言，對(duì)131 1 緒論于大多數(shù)靶物質(zhì)在8～15次循環(huán)中即可得到親和富集，2天內(nèi)可完畢一次SELEX循環(huán)。一種典型的SELEX過程普通持續(xù)2~3個(gè)月。現(xiàn)在SELEX過程己實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，可將人為因素的干擾減小到最低，在微型自動(dòng)化分析儀上可同時(shí)執(zhí)行多個(gè)橢士M壬詹?！薄薄彬酵蹩陴蹂{“M啦侗棚南甫h“持圾汁如青’鬲且。1’斡w’嗽，f雄‰∞1*《}t；_(t臂≯{_‘●—————=====2=￡o=￡羔粼o￡：。==：=C￡，=====：=盤llb繕oof糯fld0偽DNA§鑭t攤lK然i驂lpc’R：彭‘ls【，NAf穆-'XStrant如蜚弘讎it吵＼冶擻刪on@輻D＼，、pool餅 RNApool，筑lsolationand ／，， 、＼@cha豫ac^騭掰娃m ／ 、＼、簡(jiǎn)R＼T-、PC／R儀，@ ⅨR A翻il羔Of協(xié)rget撇砷c^吲∞nm 撇畔蟛!f＼ ，≤lutlo，n，s。s1)NA_—一一一”●～ ” ‘參4一～’彬圖1．6SELEX技術(shù)流程示意圖1．3．2適配體與靶物質(zhì)的作用原理適配體與靶物質(zhì)的結(jié)合普通是基于核酸鏈的三維構(gòu)造和本身的柔韌性。在溶液中，單鏈核酸鏈在空間上可朝不同的方向延伸而形成多個(gè)各樣的空間構(gòu)像。在與靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)，通過核酸鏈內(nèi)某些堿基互相之間的互補(bǔ)配對(duì)、疏水堆積作用、氫鍵作用、范德華力和靜電作用等核酸鏈會(huì)折疊而形成某些適合靶物質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定的空間構(gòu)造，如發(fā)夾(haripin)、假結(jié)(pseudoknot)、G．四股螺旋／G．四分體(G．quartet)、鼓包(stem．bulge)等(如圖1．7)。決定這些構(gòu)造的堿基往往是與靶物質(zhì)結(jié)合的重要位點(diǎn)，這樣形成的適配體構(gòu)造與靶物質(zhì)之間有較大的接觸面積，能與靶物質(zhì)緊密結(jié)合，含有高親和力和高特異性。這樣核酸適配體能將配體包埋于特定的立體構(gòu)象中，例如核酸適體通過三路交叉綁定與可卡因的特異性作用Il叫。在多數(shù)的核酸適配體與配體的結(jié)141緒論合作用中堆積作用扮演1緒論合作用中堆積作用扮演核心角色，另一方面是氫鍵作用。對(duì)于構(gòu)造復(fù)雜的靶物質(zhì)大分子(如蛋白質(zhì)等)，由于存在著多個(gè)復(fù)雜的作用力，靶物質(zhì)分子可能含有一種或者兩個(gè)連接適配體的活性位點(diǎn)，普通而言，靶物質(zhì)分子中一種識(shí)別位點(diǎn)只對(duì)應(yīng)一條特定序列的核酸適體，夾心型復(fù)合物中兩條適配子是兩條不同的核酸序列?，F(xiàn)有研究表明，氨基葡糖苷與其適體識(shí)別的重要作用力為形狀匹配和靜電作用11051；精氨酸與其適配體識(shí)別的重要因素是分子側(cè)鏈進(jìn)入核酸分子折疊部位的深處，和核酸的堿基形成較強(qiáng)氫鍵作用【l嗍；孔雀綠與其適配體的識(shí)別是互相誘導(dǎo)的適應(yīng)性識(shí)別l107】。Stem—bulge Combination撕一E上曬、／尋 ～睇Pseudoknot ．T-junction圖1．7核酸適配體和靶物質(zhì)結(jié)合的幾個(gè)方式1．3．3核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)適配體用于生物傳感器的設(shè)計(jì)含有很大的優(yōu)勢(shì)，重要體現(xiàn)在下列幾個(gè)方面：首先，適配體含有高親和力和特異性。核酸適配體序列是通過SELEX技術(shù)多次嚴(yán)格篩選出來的，故其與靶物質(zhì)之間的結(jié)合能力相稱強(qiáng)，核酸適配體與靶分子的解離常數(shù)(腸值)能夠達(dá)成nM、甚至pM水平【1081。Jiang等【1051運(yùn)用原子力顯微鏡(atomicforcemicroscropy，AFM)通過比較免疫球蛋白E(IgE)與其核酸適配體及其單克隆抗體的互相作用，證明了核酸適配體．IgE的親和力能夠與單抗．IgE的結(jié)合相媲美。核酸適配體在和靶物質(zhì)結(jié)合時(shí)能夠形成多個(gè)形狀的空間構(gòu)造，這種構(gòu)造只對(duì)靶物質(zhì)有效，故能夠分辨出靶物質(zhì)構(gòu)造上的細(xì)微差別，只識(shí)別與其互補(bǔ)的空間構(gòu)造，含有高度特異性。151緒論另一方面1緒論另一方面，適配體能夠通過化學(xué)辦法快速合成，成本低，周期短。用來檢測(cè)蛋白質(zhì)的常規(guī)免疫分析辦法所需的抗體要依賴于細(xì)胞或是動(dòng)物才干獲得，最少要3確個(gè)月，周期長(zhǎng)、成本高；然而適配體篩選過程普通只需2~3個(gè)月，比較快的篩選僅僅需在兩三周內(nèi)就能夠獲得，在篩選過程中結(jié)合某些現(xiàn)在先進(jìn)的分離技術(shù)，能在幾天之內(nèi)完畢篩選過程，如Bows一109】等在SELEX技術(shù)中采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離，通過2,-4輪的篩選就得到了HIV-1的適配體。適配體一旦篩選出來后，合成起來就非常容易。核酸適配體是由體外篩選得到的，不依靠動(dòng)物及細(xì)胞等內(nèi)環(huán)境，篩選條件(溫度、pH、緩沖體系)可按需要調(diào)節(jié)，篩選過程普通只需要8～15個(gè)循環(huán)，約2～3個(gè)月時(shí)間，現(xiàn)在其篩選過程已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化Itlo]，因此含有精度高、重復(fù)性強(qiáng)、批與批之間差別小、無免疫原性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠在常溫下儲(chǔ)存和運(yùn)輸。而抗體重要是由動(dòng)物免疫生產(chǎn)，批與批之間差別較大并且耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)抗體是大分子，對(duì)濕度、溫度等敏感，難保存，易變性，且變性后不能復(fù)性。再次，與核酸適配體作用的靶物質(zhì)非常廣泛。核酸適配體的靶物質(zhì)能夠是無機(jī)離子【111·1121、蛋白廚1131、核酸、氨基酸‘114-1151、小分子物質(zhì)、單糖、抗生素[116-117】、植物凝集素、完整的病毒顆粒、有機(jī)染料【11引、藥品等，涉及范疇十分廣泛。理論上來講，通過SELEX技術(shù)能夠篩選得到任何對(duì)應(yīng)靶物質(zhì)的核酸適體。最后，適配體容易進(jìn)行修飾?？贵w的修飾、標(biāo)記都比較困難，有可能造成親和力喪失；而核酸適配體普通是一段單鏈的寡聚核苷酸，可在合成時(shí)就連接其它功效基團(tuán)和分子，且標(biāo)記普通不影響其與配體的親和力以及它本身的生物活性。特別是RNA核酸適配體在應(yīng)用中容易被核酸酶降解，必需對(duì)寡核苷酸配基進(jìn)行多個(gè)修飾，以進(jìn)一步提高其特異性和穩(wěn)定性。總而言之，不管是在制備，對(duì)目的物的結(jié)合性和選擇性，還是在分子構(gòu)造及性質(zhì)方面，核酸適配體與抗體相稱或者更有優(yōu)勢(shì)，因此適配體在應(yīng)用方面的前景將非常廣闊。1．3．4核酸適配體在生物傳感器中的應(yīng)用適配體的研究是典型的綜合性強(qiáng)的交叉學(xué)科領(lǐng)域，需要化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科的融合交叉，同時(shí)也為各學(xué)科提出新的科學(xué)問題和推動(dòng)各有關(guān)學(xué)科的發(fā)展。作為新型的功效分子適配體近年來已在生命科學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域獲得了16l緒論愈來愈多的應(yīng)用【1191?；谶m配體特異性識(shí)別，科學(xué)家們已設(shè)計(jì)出許多新型的傳l緒論愈來愈多的應(yīng)用【1191?；谶m配體特異性識(shí)別，科學(xué)家們已設(shè)計(jì)出許多新型的傳感體系，并通過納米粒子、量子點(diǎn)、熒光染料、熒光共軛高聚物、核酶的催化活性、電化學(xué)活性探針及核酸的級(jí)數(shù)擴(kuò)增特性及鏡像適配體的手性識(shí)別特性等多個(gè)形式增加檢測(cè)敏捷度【120。1271，不僅發(fā)展出多個(gè)小分子、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞的檢測(cè)辦法且為蛋白質(zhì)功效及構(gòu)造研究提供了有力的工具。隨著適配體技術(shù)的不停進(jìn)步，適配體在許多領(lǐng)域?qū)⒂锌赡艹蔀榭贵w技術(shù)有益的補(bǔ)充；適配體在分析化學(xué)、蛋白質(zhì)組研究、基因調(diào)控、疾病治療與新藥研發(fā)等方面都含有廣闊的應(yīng)用前景。生物傳感器是依賴于抗體、酶、受體和核酸等分子識(shí)別元件的作用來構(gòu)建的。將適配體作為生物傳感器的識(shí)別元件是基于寡核苷酸適配體相對(duì)于抗體的優(yōu)點(diǎn)，而制成適配體生物傳感器(Aptasensors)?，F(xiàn)在Aptasensors尚處在起步階段。同時(shí)考慮到G．四鏈體和適配體同屬于核酸序列，能夠很容易地將富G序列與適配體序列進(jìn)行適宜的組合用以進(jìn)行傳感器的設(shè)計(jì)。，WillIler課題組報(bào)道了一種通用的適配體傳感器設(shè)計(jì)辦法，合用于小分子底物及蛋白質(zhì)的測(cè)定(圖1．8A)”o】。在該辦法中，使用了兩條寡核苷酸鏈(鏈5和鏈6)，鏈5由兩部分構(gòu)成：適配體序列與富G序列。鏈6同樣也由兩部分構(gòu)成，分別與鏈5上的適配體序列及富G序列的部分序列互補(bǔ)。在沒有待測(cè)底物的存在狀況下，鏈6的兩部分協(xié)同結(jié)合在鏈5上，形成鏈5／鏈6二倍體，二倍體的形成使富G序列不能折疊成G．四鏈體構(gòu)造，因而在加入hemin后不顯示酶活性。而在待測(cè)底物的存在狀況下，鏈5上的適配體序列與待測(cè)底物特異性結(jié)合，破壞了鏈6與適配體序列的結(jié)合，最后造成鏈6從鏈5上解締下來，釋放出來的富G序列折疊成G．四鏈體，并在hemin的存在下形成含有催化活性的DNA酶。將此辦法用于單磷酸腺苷(AMP)和溶解酵素(Lysozyme)的定量檢測(cè)，檢測(cè)限分別可達(dá)成4×10擊M(以ABTS作為氧化底物測(cè)AMP)和4×l003M(以魯米諾作為氧化底物測(cè)溶解酵素)。上述適配體傳感器的設(shè)計(jì)使用了兩條寡核苷酸鏈。隨即Willner課題組又證明，只使用一條寡核苷酸鏈(圖1．8B，鏈7)同樣可完畢類似的適配體傳感器的設(shè)計(jì)【1311。他們可將適配體序列與富G序列用一定長(zhǎng)度的堿基序列鏈接，并通過在鏈的3’．端引入適宜的序列使整條鏈形成一種莖．環(huán)構(gòu)造，由于富G序列被包埋在莖．環(huán)構(gòu)造的內(nèi)部而無法形成G．四鏈體，因此不能顯示酶的活性。然而在加入適配體底物后，由于適配體序列與底物互相作用則造成莖．環(huán)構(gòu)造被破壞，釋放171 1 緒論出來的富G序列折疊成G．四鏈體，加入hemin后形成含有催化活性的DNA酶。該課題組將此辦法成功地應(yīng)用到AMP和溶解酵素的定量檢測(cè)，檢測(cè)限分別為50肛M和0．5pM。A 疆6 }e捌汽I11．()，I．umin，貉，A，i l一”o一嘲r +，一A挎r妒’In。、、、一一 ● A|；J‘S¨糾ninl霞S±9·ACEIrGGGGG^GTAllGCGGAGGAAGCrrn廣r蛋CACl耵GGC似Gt；GCGGGl7rGGGtforAMP’S’·小叮ACGA^11X?AT(?A(；G‘；C．|^AAGAGTGCAGAGHACT了A(；1’I．TlT"mll～(’‘●r11’(X；(；1．A‘淞G‘℃GG’rl‘(；GG《協(xié)r1．姆“磺嘲tl1黢矗!S，-TACC('，VLAGATll。T．11‘TC℃?T1．(?CTC‘forAMP)5．一．1At’‘?‘：AA^‘玉暇下1．1T11_11．I下l。l飄℃A‘；1．AArI≮’陽‘■f下C(fmri雇戮眨籮啪tl圈 鏹7．～BTS黲：AyLy～ozym(- lln●=liemtn ■，姑w鏈7{S,oGGGTAGGGCGGGTTGGGAAC(TI-fCCI"GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT'rCCC(forA、lP’S'-GGGTIGGGCGGGATGGGCTAAGTAAATC'[ACGAA'rrcATCAGGCC譬A-^AGAG列=；CAr；ACT．rA(冀了AG(X：C(rerLy嘴'mc)K’ ；ABl．S●■一liemin 籽p?鏈#◆ABl‘9鑲窖{5’．GGTTGGTGTGGIWGGs'·AGTCCGTGGTACGGCA6GTTGGCCTGACT圖1．8 G-四鏈體一heminDNA酶用于適配體底物的檢測(cè)：(A)和(B)是AMP和溶解酵素的檢測(cè)，(A)使用兩條寡核苷酸鏈1130l，(B)使用一條寡核苷酸鏈‘131J；(C)是使用凝血酶適配體進(jìn)行凝血酶的檢測(cè)【1321。1緒論同時(shí)就某些適配體而言，本身可折疊成G．四鏈體1緒論同時(shí)就某些適配體而言，本身可折疊成G．四鏈體構(gòu)造。如凝血酶適配體(圖1．8C，鏈8)，能夠折疊成帶有兩個(gè)G．四分體平面的反平行G．四鏈體。但此G．四鏈體的存在并不會(huì)對(duì)hemin的酶活性帶來太大的影響，即不能形成含有高催化活性的G．四鏈體-heminDNA酶。但研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)加入凝血酶后，可在一定程度上增加G．四鏈體．hemin的酶活性【1321。究其因素可能是形成了G．四鏈體-hemin-凝血酶的三元絡(luò)合物。運(yùn)用凝血酶對(duì)酶活性的影響則能夠進(jìn)行凝血酶的定量檢測(cè)，檢測(cè)限為20nM。1922ArP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用2 ATP對(duì)G四鏈體．heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用DNA酶是含有催化活性的DNA分子，它能夠催化化學(xué)反映。DNA酶與蛋白質(zhì)酶相比含有很大的優(yōu)越性：合成比較容易、便宜，本身穩(wěn)定、不易水解和熱分解，且容易改善【”¨341。因此，含有不同活性DNA酶的開發(fā)引發(fā)了極大的關(guān)注【57，1351。含有過氧化物酶活性的G．四鏈體-herninDNA酶【58’136】是DNA酶中非常重要和普通的一種酶，它已廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、DNA乃至小分子、金屬離子等目的物[60，62捌,87．-89,91,97,99,130’13_14l】。盡管含有過氧化物酶活性G．四鏈體-heminDNA酶已廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)，但更遠(yuǎn)的發(fā)展和應(yīng)用面臨著某些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)之一是：與蛋白質(zhì)酶(如辣根過氧化物酶HRP)相比，DNA酶的催化活性相對(duì)低某些【69】，因此增加DNA酶的催化效率無疑將提高DNA酶?jìng)鞲衅鞯男阅?。其中重塑DNA酶構(gòu)型能夠增加G．四鏈體．hen'tinDNA酶的活性【m‘1451，例如在G．四鏈體適宜的位點(diǎn)連接DNA雙聯(lián)構(gòu)造在一定程度上能夠提高酶活性【145】；另外酶增強(qiáng)因子的應(yīng)用也可能很大程度地增加DNA酶的催化活性。G．四鏈體．heminDNA酶為基礎(chǔ)的傳感器的另一種挑戰(zhàn)是比色底物的選擇，ABTS(2，2’．氨基．--(3．乙基．苯并噻唑啉．6．磺酸))普通作為反映底物由H202氧化為含有特性綠色的ABTS一，并在41811IIl處有很強(qiáng)的紫外吸取，與其它底物相比ABTS能夠比較快速地被H202氧化，使其比較適合于儀器分析。但是生成的陽離子自由基ABTS一在水溶液中不穩(wěn)定，通過歧化作用很快變?yōu)闊o色產(chǎn)物【591，在高濃度H202下尤為突出。因此ABTS在裸眼檢測(cè)方面不是抱負(fù)的底物【146]。反映底物TMB(3，3，5，5一四甲基聯(lián)苯胺鹽)能夠克服這點(diǎn)局限性，它已成功應(yīng)用于汞離子檢測(cè)18卅；然而使用TMB作為底物反映時(shí)間很長(zhǎng)(大概50分鐘)，同時(shí)還規(guī)定是酸性條件【1461，由此限制了TMB的應(yīng)用，并且較長(zhǎng)的反映時(shí)間使其不適于快速分析。因此如果能夠克服ABTS一歧化現(xiàn)象，ABTS就能夠作為裸眼檢測(cè)方面的抱負(fù)底物，并且有望在一定程度上提高原有傳感器設(shè)計(jì)的敏捷度。本文中研究了ATP對(duì)G．四鏈體．heminDNA酶參加的催化反映的影響，結(jié)果表明ATP不僅能夠增加G．四鏈體-heminDNA酶的催化活性，也能夠克制ABTS斗的歧化作用。因此ATP能夠作為G．四鏈體．hemainDNA酶的增效因子。2022ATP對(duì)G．四鏈體-heroinDNA酶催化反映的增進(jìn)作用2．1 實(shí)驗(yàn)部分2．1．1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑TC．48／H(t)型基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀(杭州博日科技有限公司)；UV．1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；UB．7型pH酸度計(jì)(北京賽多利斯科技儀器有限公司)；TGL．16C型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；H．1型微式混合器(上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司)；BSl24S型電子天平(北京賽多利斯科技儀器有限公司)；尼康coolpixP4數(shù)碼攝影機(jī)。DNA從上海生工生物技術(shù)有限公司定制合成(中國(guó)，上海)，寡核苷酸的濃度以單鏈濃度表達(dá)，其濃度通過檢測(cè)在波長(zhǎng)九=260nm處吸光度測(cè)得，通過最近鄰近似法計(jì)算得到摩爾消光系數(shù)【1471。TritonX．100，hemin，Tris，HCl，HAC，KAC，ABTS，H202，DMSO，TMB，HRP，金屬鹽NaCl，KCl，KAc，AgN03，Mg(N03)2，Cu(N03)2，Mn(Ac)12，Zn(Ac)2，Cr(N03)3，Pb(N03)2，Ni(N03)2，Co(At)2，Cd(N03)2，F(xiàn)e(N03)3，Hg(Ac)2和Ca(At)2都從Sigma公司購(gòu)置，且都為分析純。ATP，ADP，AMP，腺苷，CTP，G即，UTP，dATP，dCTP，dGTP，d唧和dUTP都從Ferrnentas(EU)購(gòu)置，且都為分析純。DNAs溶液：溶于二次去離子水中，通過測(cè)量260nm處的吸光值擬定單鏈的濃度。Heroin溶液：稱取0．01304g的h既1iIl，溶于4mLDMSO中，根據(jù)需要稀釋。本實(shí)驗(yàn)所用到的寡核苷酸鏈以下：CatG4：5’．TGGGTAGGGCGGGTTGGGAAA．3’Hum24：5’一1-I’AGGGrI'AGGGTI'AGGGl-I'AGGG．3’TBA：5·．GGTTGGTGTGGTrGG．3·2．1．2 G．四鏈體一heminDNA酶的光度分析DNA樣品溶解在含10mMTris-HCl(pH=7．4)，10mMKCl，100mMNaCI，2l2 2 ATP對(duì)G．四鏈體．heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用0．002％(V／v)TritonX．100的緩沖溶液中，DNA溶液濃度為O．1itM，其混合溶液98℃條件下加熱13min來消除DNA的聚集以確保隨即G．四鏈體構(gòu)造的形成，降至25℃后反映30min；加入ATP(終濃度為2mM)，25℃下反映30min；再加入hemin(終濃度為0．2rtM)，在25℃下放置反映1h；然后加入ABTS(終濃度為O．5rnM)和H202(終濃度為1．2mM)，用數(shù)碼相機(jī)統(tǒng)計(jì)反映后混合液的顏色隨時(shí)問的變化，用紫外可見分光光度計(jì)掃描10min后的反映體系的吸取光譜，取波長(zhǎng)九=418nnl處的吸光度值做定量分析。當(dāng)體系中加入的是以O(shè)．5mMTMB作為反映底物時(shí)，檢測(cè)在波長(zhǎng)九=372nln和652nln處的吸取強(qiáng)度。2．1．3DNA．hemin的親和力的分析不同濃度的DNA樣品溶解在含10mMTris．HCI(pH=7．4)，10mMKCl，100mMNaCl，0．002％(v／v)TdtonX．100的緩沖溶液中，將DNA混合溶液在98"C條件下加熱13min來消除DNA的聚集以確保隨即G．四鏈體構(gòu)造的形成，緩慢降溫至25℃后反映30min；加入ATP(終濃度為0mM或2mM)，25℃下反映30min；再加入hemin(終濃度為0．2山)在25℃下放置反映1h；然后加入ABTS(終濃度為O．5mM)和H202(終濃度為1．2mM)，用紫外可見分光光度計(jì)統(tǒng)計(jì)1min后的反映體系在波長(zhǎng)九=418am的吸取強(qiáng)度?？赏ㄟ^下列公式計(jì)算解離平衡常數(shù)Katl刪：【DNA]o=Kd(彳x—Ao)／(彳。一Ax)+【hemin]o(彳工一Ao)／(彳∞一彳o)其中[DNA]o和[hemin]o為DNA和hemin的初始濃度，40，彳x和A。分別代表不加入DNA、加入某一濃度的DNA、加入過量DNA時(shí)反映體系的吸光度。2．1．4A礦中斷DNA酶催化的體系中ATP克制ABTS一歧化作用的研究CatG4溶解在10mMTris-HAg(pH=7．O)，5mMKmc，0．002％(v／v)TritonX-100的緩沖溶液中，CatG4濃度為O．2gM，其混合溶液98℃條件下加熱13rain來消除DNA的聚集以確保隨即G．四鏈體構(gòu)造的形成，降至25℃后反映1h；加入hemin(終濃度為1pM)在25"C下放置1h；再加入ABTS(終濃度為O．5mM)和H202(終濃度為1．2mM)反映10mill；然后加入A礦(終濃度為20洲)和ATP(終濃度為2mM)，統(tǒng)計(jì)1min后波長(zhǎng)九‘=418nnl處吸取信號(hào)隨時(shí)間的變化。22ATP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用2．1．5 G．四鏈體．HcminDNA酶催化反映的動(dòng)力學(xué)研究DNA樣品(O．1¨MCatG4或0．2“MHum24)溶解在含10mMTris—HCI(pH=7．4)，10mMKCl，100mMNaCl，0．002％(v～)TritonX．100的緩沖溶液中，其混合溶液98℃條件下加熱13min來消除DNA的聚集以確保隨即G．四鏈體構(gòu)造的形成，降至25℃后反映30mira加入不同濃度的ATP，在25℃下反映30min；再加入hemin(終濃度為0．2gM)至混合溶液，25℃下放置反映1h，然后加入ABTS或TMB(終濃度為0．5mM)和H202(終濃度為O．5mM)，快速混合，立刻用紫外可見分光光度計(jì)統(tǒng)計(jì)波長(zhǎng)九=418nnl處吸取信號(hào)隨時(shí)間的變化。特別注意的是本實(shí)驗(yàn)中使用低濃度的H202(O．5mM)，選用低濃度H202有下列兩個(gè)因素：(1)在G．四鏈體-hcminDNA酶催化ABTS．H202反映中，催化反映的速率隨H202濃度的增大而增強(qiáng)，而不隨ABTS的濃度變化。若使用高濃度的H202，反映動(dòng)力學(xué)太快而無法跟蹤統(tǒng)計(jì)。(2)高濃度的H202能夠加緊ABTS一的歧化作用，在反映動(dòng)力學(xué)的研究中要將ABTS一的歧化作用的影響減少到最小，因此選擇低濃度的H202。2．1．6 Ag+的檢測(cè)CatG4溶液(40nM)溶解在10mM"Iris．HAc(pH=7．O)，5mMKAo，0．002％(v／v)TritonX．100的緩沖溶液中，其混合溶液在98℃條件下加熱13min來消除DNA的聚集，降至25℃后反映30mint然后加入ATP(終濃度為2mM)和不同濃度的A礦，25℃下反映30mira加入hcmin(終濃度為o．2gM)，25℃下放置1h；然后加入ABTS(終濃度為O．5mM)和H202(終濃度為1．2mM)，用TU．1901紫外可見分光光度計(jì)掃描10min后的反映體系的吸取光譜，取波長(zhǎng)九=418nnl處的吸光值做定量分析。2．2實(shí)驗(yàn)成果與討論2．2．1 CatG4和ATP對(duì)hemin紫外可見光譜的影響在G．四鏈體一heroinDNA酶體系中，G．四鏈體能夠結(jié)合hcmin并且給hcmin22ATP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用提供能夠增強(qiáng)其活性的環(huán)境【58，1361。G．四鏈體與heroin的結(jié)合反映能夠通過紫外．可見吸取光譜進(jìn)行分析，如圖2．1A：hemin本身于397nm處有吸取譜帶；加入ATP能夠略微提高譜帶的吸取強(qiáng)度；CatG4是G一四鏈體-heroinDNA酶研究中廣泛使用的一條富G的寡核苷酸鏈[24，97—46]。當(dāng)加入CatG4時(shí)，會(huì)引發(fā)hemin吸取譜帶紅移至404nin并隨著明顯的增色效應(yīng)。這是由于CatG4折疊成了G．四鏈體，該G．四鏈體與hcmin發(fā)生了強(qiáng)烈的互相作用。當(dāng)在CatG4一hemin體系中繼續(xù)加入ATP時(shí)會(huì)引發(fā)了吸取譜帶的強(qiáng)度進(jìn)一步提高。A。0．．0．。0·g0．一七0．墨0．《0．0．0．-0．Wavelength(nm)B8磊七寶乏Wavelength(nm)圖2．1 CatG4和ATP對(duì)heroin紫外可見光譜的影響(A)和對(duì)heroin催化反映的影響(B)，其r扣[heroin】=0．2gM，[CatG4]=0．1州，[ATP】-2mM。2422ATP對(duì)G．四鏈體-heminDNA酶催化反映的增進(jìn)作用成果表明：CatG4和ATP都能夠結(jié)合hemin，CatG4-hemin的結(jié)合能力比ATP．hernin強(qiáng)；另外ATP的存在也可能增強(qiáng)CatG4-honin的親和力，通過研究ATP存在與否兩種狀況下CatG4．hemin的親和能力，即引用Li等使用的測(cè)定方法【144】以測(cè)定CatG4．hcmin的解離平衡常數(shù)碭能夠證明這一觀點(diǎn)。從實(shí)驗(yàn)成果可以看到，ATP不存在狀況下CatG4-hemin的局值是加入2mMATP狀況下的近2．5倍，即表明加入2mMATP時(shí)CatG4．hemin的親和力是ATP不存在狀況下的近2．5倍(如表2．1與圖2．2)?！綜atG4】(r峋(Ax。Ao)／(A-Ax)圖2．2 (A)ATP濃度分別為0mM(方塊)與2mM(圓點(diǎn))兩種狀況下催化反映體系在波長(zhǎng)九=418rml處的吸光度值隨CatG4濃度