實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因

實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因核心提示:【摘要】nbsp;nbsp;本研究旨在建立用實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病（APL）PMLRARanbsp;mRNA的方法，探討APLnbsp;PMLRARa融合基因表達水平與療效的關系。用RTPCR擴增培養(yǎng)的NB4細胞的PMLRARa融合基因，取1pgnbsp;NB4細胞的總cDNA進行10倍的作者：段連寧郎麗李惠民劉華王義民張學美【摘要】本研究旨在建立用實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）PMLRARamRNA的方法，探討APLPMLRARa融合基因表達水平與療效的關系。用RTPCR擴增培養(yǎng)的NB4細胞的PMLRARa融合基因，取1pgNB4細胞的總cDNA進行10倍的梯度稀釋，作為標準品，建立熒光定量RTPCR方法，對方法的靈敏性、穩(wěn)定性、重復性進行了測定。定量檢測4例急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）患者治療前后骨髓內(nèi)PMLRARa融合基因轉(zhuǎn)錄本水平，并對1例經(jīng)治療完全緩解后又復發(fā)的患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）進行動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果表明：用本研究建立的實時定量RTPCR方法可檢測出10-5pgNB4細胞cDNA中的PMLRARa融合基因，其重復性的CT值，管間、批間變異系數(shù)（CV）分別為2.1%、3.8%。4例患者初治骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平的分別為1884、5533、1803、4677拷貝，平均為3475拷貝。經(jīng)ATRA+化療治療后其PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄水平下降至40、135、79、229拷貝，平均為121拷貝。還有1例患者治療前PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8600拷貝，經(jīng)過4個月治療，雖然此時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個月后患者出現(xiàn)復發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11000拷貝。經(jīng)過ATRA+化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1200拷貝。結(jié)論；建立的實時定量RTPCR靈敏、重復性好。治療后APL患者的PMLRARa融合基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯下降，復發(fā)時基因轉(zhuǎn)錄本水平又升高。融合基因表達水平的改變與臨床疾病進展關系一致，這有助于監(jiān)測白血病微小殘留病，評價療效及判斷預后?！娟P鍵詞】急性早幼粒細胞白血病DetectionofPML/RARaTranscriptsinAcutePromyelocyticLeukemiabyRealtimeQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReactionAbstractTihsstudywaspurposedtoestablisharealtimequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction（RTPCR）fordetectionofPML/RARafusiongeneinpatientswithacutepromyelocyticleukemia（APL）andtoexploretherelationshipbetweentheexpressionlevelofPML/RARafusiongenetranscriptandtheclinicalstatusorefficacyofthetherapyinAPL.TheconventionalRTPCRwasusedtoamplifyPML/RARagenefromculturedNB4cells.StandardcurveswereconstructedbymodifiedrealtimePCRonstandardtemplateafter10foldserialdilutionsofcDNAof1|igNB4cells.Thesensitivity,stabilityandrepeatabilityofthismethodwasdetermined.ThePML/RARagenetranscriptsofbonemarrowsin4APLpatientsbeforeandaftertreatmentandin1APLpatientrelapsedaftercompleteremissionweredynamicallydetectedbymodifiedrealtimequantitativeRTPCR.TheresultsindicatedthatthesensitivityofrealtimequantitativeRTPCRfordetectingPML/RARafusiongenewasabout10-5|igcDNAfromNB4cells,therepeatabilityandreproducibilityofthismethodweresatisfactory,intraandinterassaycoefficientsofvariationwere2.1%and3.8%.ThecopynumbersofPML/RARatranscriptereflectingPML/RARafusiongeneexpressionlevelin4newlydiagnosedpatientswithAPLwere1884,5533,1803,4677andthemedianwas3475.AfterATRA+chemotherapycopynumbersofPML/RARatranscriptdecreasedto40,135,79,29,andmeanwas121.Anotherpatient'sPML/RARagenecopynumberwas8600atdiagnosis,thegenecopynumberwas730aftertherapyfor4months,althoughhewasincompleteremission,butcopynumberincreasedto11000whenAPLrelapsed3monthslater.Thecopynumberefficientlyreducedto1200afterATRA+chemotherapy.ItisconcludedthattheestablishedrealtimequantitativeRTPCRmethodissensitive,reliable,accurateandrepeatable.Theefficiencyofmethodwasfinallytestedforpatientsamples,showingaPML/RARatranscriptcopynumberinAPLpatientssignificantlydecreaseaftertherapy,andincreaseatthetimeofrelapsewhichindicatethatchangesoffusiongeneexpressionlevelscoincidewithclinicalprogressofdisease.Thismethodcanbeusedtodetecttheminimalresidualdisease,assessresponsetotreatmentandevaluateprognosisofdisease.KeywordsrealtimequantitativeRTPCR;acutepromyelocyticleukemia;PMLRARafusiongene;minimalresidualdisease實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病PMLRARa融合基因急性早幼粒細胞白血病（APL）具有特異性的染色體易位t（15;17）易位，使17號染色體上的RARa基因與15號染色體上PML基因融合，產(chǎn)生融合基因PMLRARa。實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，自動化程度高，因而其應用也越來越廣泛。我們應用這一方法檢測PMLRARa融合基因作為APL臨床診斷、評估微小殘留病（MRD）和判斷其預后的手段。材料和方法主要儀器PE9600型定性PCR擴增儀（美國PerkinElmer公司產(chǎn)品），PowerPac3000型電泳儀，GelDoc1000紫外圖像分析系統(tǒng)和配套分析軟件（BioRad公司產(chǎn)品），GeneAmp5700SequenceDetecor定量PCR擴增儀及配套分析系統(tǒng)和配套分析軟件（美國BioRad公司產(chǎn)品）；5700型定量PCR儀（美國ABI公司產(chǎn)品）；5417R高速冷凍離心機和5415C高速離心機（德國Eppendorf公司產(chǎn)品）。主要試劑RPIM1640（Gibco公司產(chǎn)品）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品）淋巴細胞分離液（中國協(xié)和醫(yī)科大學生物研究所產(chǎn)品）；TRIzoL試劑（美國MRC公司產(chǎn)品）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司產(chǎn)品）；PMLRARa基因、p肌動蛋白（Bactin）寡核苷酸引物（上海生工生物工程公司產(chǎn)品）；DEPC水（焦碳酸二乙酯）（BioBasicInc產(chǎn)品）；LoadingBuffer,DNAMarkerDL2000,TaqDNA聚合酶,dNTP（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品）；SybrGreenI染料（美國BioRad公司產(chǎn)品)。檢測標本細胞系NB4細胞(引自上海瑞金醫(yī)院血液研究所)常規(guī)培養(yǎng)。骨髓標本取自5例APL患者的骨髓(男3例，女2例，14歲-42歲，平均年齡30歲)。單個核細胞的分離及總RNA提取取患者EDTA抗凝骨髓2ml，用淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞，然后對單個核細胞和培養(yǎng)的5X106個NB4細胞，分別采用TRIzoL試劑并按試劑操作說明書提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｒ锏脑O計和合成PMLRARa融合基因形成過程中，RARa上的斷裂點總是位于第2個內(nèi)含子內(nèi)，但是PML上的斷裂點存在很多變異，主要集中在3個斷裂點叢集區(qū)(bcr)。bcr1在第6個內(nèi)含子內(nèi)，形成長型轉(zhuǎn)錄本(L)。斷裂點bcr3在PML第3個內(nèi)含子內(nèi)，產(chǎn)生短型轉(zhuǎn)錄本(S)；而bcr2斷裂點位于第6外顯子內(nèi)形成變異型轉(zhuǎn)錄本(V)。這3種轉(zhuǎn)錄本分別占70%(L)，20%(S)和10%(V)。我們檢測了L型融合基因拷貝數(shù)。L型引物序列參照了國外文獻[1],應用B-actin作為內(nèi)對照，具體序列如下表：L型上游引物P6：5’GTCTTCCTGCCCAACAGCAACC3'(190bp)；下游引物R1：5’CTCACAGGCGCTGACCCCATAGT3。|3actin上游弓|物：5’AACGGCTCCGGCATGTGCAA3(117bp)，下游引物：5’CTTCTGACCCATGCCCACCA3'cDNA合成取1pg總RNA，采用cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，20p丨體系的組成如下：隨機引物(oligodT0.5pg/pl)1pl,5Xbuffer4pl,RNA酶抑制劑(20U/pl)1pl,10mmol/LdNTPMix2pl,逆轉(zhuǎn)錄酶(MMULV)1pl。反應條件37C5分鐘,42C60分鐘,70C10分鐘。cDNA合成后以cDNA為模板進行Bactin管家基因的PCR擴增(圖1),判斷是否逆轉(zhuǎn)錄成功。Figure1.ElectrophoresispatternofPactinamplifiedbyRTPCRonagarosegel.轉(zhuǎn)錄本類型的定性PCR確定取上述cDNA2pl作為模板，以L型的正反向引物進行PCR反應。25pl體系包括10Xbuffer2.5pl，MgCl2(25mmol/L)2.5pl，dNTP(10mmol/L)1pl,Taq酶(5U/pl)0.2pl,正反相引物均為1pl。反應條件：94C5分鐘，94C45秒，60C60秒，72C90秒，共40個循環(huán)，72C6分鐘。L型轉(zhuǎn)錄本的擴增長度190bp。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖2：退火溫度為58C時在250-500bp之間有非特異性條帶，60C時非特異性條帶較58C時少，我們選擇60C為退火溫度。Figure2.ElectrophoresispatternofPMLRARaamplifiedbyRTPCRonagarosegel.L型PMLRARa基因標準品的構(gòu)建用紫外分光光度計測NB4細胞的cDNA的濃度后，取1pg的cDNA依次進行10倍的梯度稀釋，分裝為1pg，10-1pg，10-2pg，10-3pg，10-4pg，10-5pg作為各自的標準品。（在NB4細胞中1pg的cDNA包含104拷貝的PMLRARa基因［1］）（圖3）。Figure3.Amplificationcurvesofreferenceat102-104initiationcopynumber.定量PCR反應定量PCR反應體系25pl體系中包括10XBuffer2.5pl,MgCI2（25mmol/L）2.5pI,dNTP（10mmol/L）1pl,Taq酶（5U/pl）0.2pl,正反相引物均為1pl,cDNA或標準品2pl，SYBERGREEI染料3pl。熔解曲線分析先按94°C5分鐘，94°C45秒，60°C60秒，72°C90秒，40個循環(huán)，72°C6分鐘的反應條件進行定量PCR反應。反應結(jié)束后，儀器自動進行了熔解曲線分析，如圖4示：從熔解曲線圖中可見到兩個峰，一個峰值在69C左右，另一個峰值在88C左右。69C左右的峰為引物二聚體小片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的°88°C左右的峰為目的片段和染料結(jié)合釋放熒光產(chǎn)生的。我們?yōu)榱讼∑畏翘禺惍a(chǎn)物的影響，在延伸后加了升溫至87C，持續(xù)5秒的步驟。則定量PCR反應條件為：94C5分鐘，94C45秒，60C60秒，72C90秒，87C5秒，共40個循環(huán)，72C6分鐘。Figure4.Analysisofmeltingcurve.Derivative（dF/Dt）:negativevalueoftentoonetimederivativeoffluorescencestrengthchangedwithtemperature.制作標準曲線將各個標準品的起始拷貝數(shù)取對數(shù)，作為橫坐標，其所對應的Ct值（循環(huán)域值，cyclethreshold）作為縱坐標，即可做出相應的標準曲線（圖5、6）。將各個樣本的平均Ct值，代入相應的標準曲線，就可求出PMLRARa基因和Bactin的拷貝數(shù)。校正的PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平（DoseN）=（PMLRARa的拷貝數(shù)/Bactin的拷貝數(shù)）X105[2]。結(jié)果方法的靈敏度對培養(yǎng)的1pgNB4細胞的cDNA，進行10倍梯度稀釋，分別用建立的熒光定量RTPCR作檢測，可得到Ct值，其檢測PMLRARa融合基因的靈敏度達10-5pgcDNA（表1），由此制作出標準曲線的相關性，相關系數(shù)為0.997。方法的穩(wěn)定性和重復性我們對104基因拷貝數(shù)的模板分別做5個反應管檢測。比較同一次反應不同反應管間的批內(nèi)變異及重復5次檢測比較不同時間的反應結(jié)果的批間變異。檢測到該濃度同一次反應不同反應管的Ct值分別為：21.8，21.5，20.8，21.4，22.0；不同時間檢測的Ct值為：20.8，21.6，22.3，23.0，21.7。批內(nèi)變異系數(shù)為2.1％，批間變異系數(shù)為3.8%。這說明本方法穩(wěn)定性和重復性均好。分析4例APL患者（經(jīng)定性PCR電泳結(jié)果確定為L型）初治時骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其轉(zhuǎn)錄本水平（拷貝數(shù)）分別為1884，5533，1803，4677，平均拷貝數(shù)為3475（表2）。以上4例APL患者經(jīng)ATRA+化療治療6個月左右后，再次檢測其PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄水平（拷貝數(shù)），結(jié)果分別為40，135，79，229，平均拷貝數(shù)為121。具體數(shù)據(jù)如表2。4例患者治療后基因拷貝數(shù)分別為治療前的了1/47，1/41，1/23，1/21。治療前后患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平的比較4例患者治療前轉(zhuǎn)錄本水平的平均數(shù)3475（1803-5533）拷貝，經(jīng)ATRA+化療治療6個月后再次檢測轉(zhuǎn)錄本水平，其平均數(shù)為121（40-229）拷貝。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗得p=0.036（＜0.05）,說明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計學意義，其具體數(shù)據(jù)見表3。4例患者治療前轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為68%,治療后變異系數(shù)大于治療前，由此推測不同患者對化療藥的敏感程度差異比較大。還有1例患者治療前基因轉(zhuǎn)錄本水平為8600拷貝，經(jīng)過4個月治療，雖然此時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。3個月后患者出現(xiàn)復發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至為11000拷貝。經(jīng)過ATRA+化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1200拷貝（圖7）。討論實時定量RTPCR（realtimequantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction,RTPCR）是在普通PCR反應中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的增加而成比例增長，儀器實時檢測每一個循環(huán)結(jié)束后的熒光強度，通過與標準曲線對比得出定量結(jié)果?？梢灾苯訖z測目的基因的起始數(shù)量，從而動態(tài)監(jiān)測融合基因水平［3］。從擴增到產(chǎn)物分析都是閉管操作，最大限度避免了污染，無PCR后處理。SYBRgreenI是一種能與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，游離時幾乎沒有熒光信號，本底很低。PCR進行過程中，它能結(jié)合到擴增產(chǎn)物雙鏈DNA的小溝中，熒光強度大大增強。實驗中產(chǎn)生的非特異性雙鏈DNA（如引物二聚體）也會和染料結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，其產(chǎn)生的干擾可通過熔解曲線分析得到解決。只要有合適的引物就可實現(xiàn)目的基因的RQPCR［4］。較之序列特異性熒光探針，它無需探針設計，大大簡化了實驗難度，且價格便宜，是一種值得推薦的熒光定量PCR技術。國外文獻報道，用熒光定量PCR方法重復40次反應，其Ct值的變異系數(shù)為1.6%。如電泳凝膠掃描定量，其變異系數(shù)高達31%，兩者相差19倍多［4］。本實驗管間、批間變異系數(shù)分別為2.1%和3.8%，與其相近。說明本方法穩(wěn)定性和重復性均好。我們使用定量RTPCR方法檢測PMLRARa融合基因的靈敏度達10-5pgcDNA,按10-5pgcDNA/細胞計算，本方法可從105個正常細胞中查出1個白血病細胞，與文獻報道的定量RTPCR方法相仿［5］。我們建立實時定量RTPCR檢測急性早幼粒細胞白血病融合基因,同時檢測同一標本的融合基因及管家基因，不必考慮RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過程中的差異，以校正拷貝數(shù)(PMLRARa的拷貝數(shù)/［3actin的拷貝數(shù))X105表示，使用管家基因Bactin對結(jié)果進行標化，更具科學性。應用實時定量RTPCR技術，不僅能夠確定患者PMLRARa轉(zhuǎn)錄本的有無，而且可確定其轉(zhuǎn)錄本水平，觀察其動態(tài)變化。通過實時定量RTPCR監(jiān)測PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平的變化，可以預測急性早幼粒細胞白血病患者的治療反應，定量白血病細胞的殘余數(shù)量和預測復發(fā)，這比細胞遺傳學檢查早數(shù)月】6,7］。我們檢測了4例APL患者初治時骨髓PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平，其分別為1884，5533，1803，4677拷貝，平均拷貝數(shù)為3475。經(jīng)ATRA+化療治療后基因轉(zhuǎn)錄水平分別為40,135,79,229拷貝，平均拷貝數(shù)為121。經(jīng)治療后PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平明顯下降，證明治療是有效的。治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平經(jīng)t檢驗得P=0.036<(0.05)，這說明治療前和治療后轉(zhuǎn)錄本水平之間差異有統(tǒng)計學意義。4例患者治療前時轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為55%,治療后轉(zhuǎn)錄水平的變異系數(shù)為68%。治療后變異系數(shù)大于治療前，由此我們可以推測，不同患者對化療藥的敏感程度差異比較大。還有1例患者治療前PMLRARa基因轉(zhuǎn)錄本水平為8600拷貝，經(jīng)過2個月誘導鞏固治療，雖然此時患者處于完全緩解期，但其轉(zhuǎn)錄水平拷貝數(shù)仍有730。5個月后患者復發(fā)，轉(zhuǎn)錄本水平升至11000拷貝數(shù)。經(jīng)過ATRA+化療治療后轉(zhuǎn)錄本水平又逐漸下降至1200?？傊瑢崟r定量RTPCR是一種快速、準確和高度敏感的實驗方法，它不僅能夠檢測到微小殘留病灶的存在，更重要的是，通過動態(tài)監(jiān)測PMLRARa轉(zhuǎn)錄本水平及其變化，可以預測急性早幼粒細胞白血病患者的治療反應，定量白血病細胞的殘余數(shù)量和預測復發(fā)，這比定性PCR檢測具有更為重要的臨床意義?！緟⒖嘉墨I】1CassinatB,ZassadowskiF,BalitrandN,etal.Quantitationofminimalresidualdiseaseinacutepromyelocyticleukemiapatientswitht(15;17)translocationusingrealtimeRTPCR.Leukemia,2000;14:324-3282GuBW，HuJ，XuL，etal．FeasibilityandclinicalsignificanceofrealtimequantitativeRTPCRassayofPMLRARafusiontranscriptinpatientswith