第五章 目的基因的獲取 3

目的基因的獲取基因工程的基本程序切PCR接轉(zhuǎn)擴(kuò)增開展基因工程首先必須獲得基因，因此有特定的功能基因分離和克隆是重組DNA技術(shù)中基本和重要的組成部分。為了體外高效表達(dá)特定的生物活性蛋白，首先要分離和克隆相應(yīng)的基因，這種基因常稱為目的基因。因目的基因片斷需插入載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)，所以對宿主細(xì)胞DNA而言，又稱它為外源性基因或外源性DNA。

目的基因的用途

研究該基因的全貌和內(nèi)涵,如詳細(xì)分析基因結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控；用正常的目的基因與異常基因分析對比，尋找其異常點，進(jìn)而探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制及治療策略；研究生物種系進(jìn)化與相關(guān)同源性；采用基因重組技術(shù)，使目的基因在體外獲得高效表達(dá)，生產(chǎn)所需要的生物活性蛋白及多肽（如干擾素、胰島素等藥物）；通過基因突變、缺失或拼接改造某種目的基因，以改良品種，生產(chǎn)新型的生物活性物質(zhì)，促經(jīng)濟(jì)發(fā)展；建立基因治療，如選用和克隆某種正?；?，引入患者細(xì)胞內(nèi)，以對某些遺傳病、腫瘤等疑難疾病進(jìn)行基因治療。目的基因的獲得1．人工化學(xué)合成法2．PCR法3．文庫篩選法4．轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法5．mRNA差別顯示技術(shù)6．生物信息技術(shù)分離和鑒定目的基因1．人工化學(xué)合成法1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其對應(yīng)的多肽鏈氨基酸序列2）較短的DNA片段，有專一性和定向性2.儀器：自動化DNA合成儀3.原理：第一個核苷酸固定于不溶性的固相載體上,然后按預(yù)定順序從該核苷酸開始，以3’、5’-磷酸二酯鍵與另一核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng)（封閉非反應(yīng)基團(tuán)），其后用洗滌法除去多余的反應(yīng)物和副產(chǎn)物,再用同樣的步驟與下一個核苷酸進(jìn)行縮合反應(yīng),如此循環(huán)將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來,解除保護(hù)基,進(jìn)一步純化。應(yīng)用范圍：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探針3）人工接頭4）合成較小的基因合成基因時，要注意使用不同物種的偏愛密碼子.1972年Khorana等首先用化學(xué)合成法合成了相當(dāng)于酵母丙氨酸t(yī)RNA結(jié)構(gòu)基因的DNA雙鏈1979年合成了包括啟動調(diào)節(jié)順序在內(nèi),長207bp的大腸桿菌酪氨酸校正tRNA基因而后人們又相繼合成了生長激素釋放抑制因子、胰島素、生長激素、α和γ干擾素、舒緩激肽、腦啡肽等基因，2.

PCR法分離目的基因（1）序列已知情況（2）序列未知情況（1）根據(jù)已知序列，采用PCR分離目的基因①已知序列是DNA片段例如：番茄defenderagainstapoptoticcelldeath（LeDAD1）序列LeDAD1序列（1）根據(jù)已知序列，采用PCR分離目的基因已知序列是mRNAmRNA：首先要分離（或純化）mRNAA:根據(jù)mRNA序列直接設(shè)計引物；B:根據(jù)mRNA序列設(shè)計一條引物和OligoT/A引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

C:逆轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（2）序列未知，采用PCR分離目的基因①序列在其他物種上已有報道：例如：擴(kuò)增楊樹PDS基因PDS基因目前已在擬南芥、番茄、甜橙等植物上有報道具體做法：

首先找出上述幾個物種的PDS基因序列，進(jìn)行比對；尋找出其保守序列，根據(jù)保守序列設(shè)計引物（或簡并引物）PCR擴(kuò)增（DNA或RNA為模板）見PDS基因設(shè)計文檔②已知部分序列，但不完全，可采取：反向PCR法（有時也稱做染色體步移法）：RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）技術(shù)可分為5’-RACE和3’-RACE5’-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以O(shè)ligo(dT)30作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV（或AMV）作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的5‘末端時自動加上3-5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM作為上游引物，用一個基因特異引物2作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因5‘末端的cDNA片段擴(kuò)增出來5’RACE原理5’RACE原理利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。然后用一個基因特異引物GSP1作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3‘末端的DNA片段擴(kuò)增出來。

3’RACE原理3’RACE原理序列在其他物種上也未見報道：采取其他方式獲取目的基因，如文庫構(gòu)建等方式。3．文庫篩選法（1）.cDNA基因文庫（2）.基因組DNA文庫cDNA基因文庫cDNAlibrariescDNA基因文庫

cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應(yīng)包含某種細(xì)胞中各種mRNA的相應(yīng)順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細(xì)胞的cDNA文庫。cDNA文庫沒有原核生物的cDNA文庫原核生物的mRNA非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫比較容易構(gòu)建，能包含所有基因的序列。cDNA文庫對于真核生物的基因分析cDNA文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫cDNAs

沒有內(nèi)含子基因可以在E.coli

中直接表達(dá)用于新基因的鑒別組織或特殊類型細(xì)胞（基因的特異表達(dá)）cDNA文庫

mRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

LigationtovectorcDNAlibrariescDNA文庫-mRNA分離

大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補(bǔ)，由此來獲得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap1.傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA2.把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強(qiáng)磁場下分離mRNA3.用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復(fù)合體（溶解細(xì)胞）來分離mRNA三種分離純化mRNA的方法用纖維素純化poly(A)mRNA的流程圖確定mRNA沒被降解

方法:mRNA的翻譯:用體外蛋白質(zhì)合成檢測mRNAs。（麥胚無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯體系或兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)譯體系）通過凝膠電泳分析mRNAs:用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cDNA文庫-檢測mRNA的完整性cDNA的合成:第一鏈的合成:

mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶，oligo(dT)，核酸末端轉(zhuǎn)移酶，dNTPs1.oligo(dT)引導(dǎo)的cDNA合成法2.隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法第二鏈的合成:

根據(jù)在第一鏈3’-末端加尾（C），用補(bǔ)充引物合成第二鏈

5’mRNA

AAAAA-3’HO-TTTTTP-5’5’ReversetranscriptaseFourdNTPsAAAAA-3’TTTTTP-5’mRNA

mRNA

cDNAcDNAcDNADuplexcDNAAAAAACCC-3’TTTTTP-5’TTTTTP-5’3’3’-CCCCCCCTerminaltransferasedCTPAlkali(hydrolyaesRNA)PurifyDNAoligo(dG)Klenowpolymerase5’-pGGGG-OH5’3’-CCCCCCC5’-pGGGG3’-CCCCCCCTTTTTP-5’-3’Thefirststrandsynthesis5’-pGGGG3’-CCCCCCCHO-CCGAATTCGGGGGG3’-GGCTTAAGCCCCCC5’-pAATTCGGGGGGTTTTTGGCTTAAGCC-OHCCGAATTCGG-3’3’-CCCC3’-CCCCCCC3’-CCCC5’-pGGGG5’-pGGGGTTTTTp-5’-3’TTTTTp-5’TTTTTp-5’-3’-3’TTTTTGGCTTAAp-5’HO-CCG/AATTCGG-3’3’-GGCTTAA/GCC-OHCCG-3’DuplexcDNASinglestrand-specificnucleaseKlenowpolymerasetreatwithE.coRImethylaseAddE.colRIlinkers

usingT4DNAligaseEcoRIdigestionLigatetovectorandtransfomSecondstrandsynthesis對cDNA末端的處理平末端的片斷需要加入特殊的核苷酸序列形成粘性末端，才能進(jìn)行克隆步驟:移去突出的3’-ends(strand-specialnuclease)填充缺失3’核苷酸(klenowfragmentofDNApolyIand4dNTPs)銜接物和平末端的連接(T4DNAligase)限制性內(nèi)切酶的消化(E.coRI)與載體的連接

任何一個含有EcoRI酶切位點的載體都可以用來克隆cDNA.步驟:載體末端脫磷酸（堿性磷酸酶）用T4DNA連接酶連接載體和cDNA(plasmidorlphagevector)cDNA文庫的優(yōu)越性1.以mRNA為材料；

（一些RNA病毒，不經(jīng)過DNA中間體，對其研究，cDNA是唯一可行的方法）2.文庫的篩選比較簡單易行；3.由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；4.克隆在細(xì)菌中表達(dá)的基因，用作基因序列的測定，和發(fā)育過程中或組織中基因特異表達(dá)

基因組DNA克隆

Genomiclibraries基因組文庫的構(gòu)建

基因組文庫（genomicDNAlibrary）：用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機(jī)地連接在載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個片段的克隆。當(dāng)制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于線粒體或葉綠體ＤＮＡ的基因文庫。由于制備ＤＮＡ片段的切點是隨機(jī)的，所以每一克隆內(nèi)所含的ＤＮＡ片段即可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側(cè)的鄰近ＤＮＡ順序。

基因文庫的構(gòu)建就是利用所謂的“鳥槍法”，使基因組的DNA片段隨機(jī)地插入適當(dāng)?shù)妮d體中，引入細(xì)胞進(jìn)行大量繁殖而構(gòu)建的?；蚪MDNA文庫純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化物理切割和限制性內(nèi)切酶eukaryotesprokaryotes與載體連接構(gòu)建基因文庫的基因組DNA必須進(jìn)行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機(jī)片斷基因組DNA的純化:

原核生物:直接從細(xì)胞中體取基因組DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂類和其它“雜質(zhì)”。真核生物

:從細(xì)胞核中Hae：5’-

…GG

/CC…

3’,Sau3A:5’-/GATC-3’,

Alu:5’-

…AG/CT…3’,BamH1:5’-G/GATCC限制性內(nèi)切酶消化將片斷的末端(粘性或平頭)和酶消化的載體連接酶切位點是否被修飾內(nèi)切酶消化的時間和用量取決于要插入片斷的大小范圍。

Lambda/HindIII:23130,9416,6557,4361,2322,2027,564,125

用于構(gòu)建基因文庫片段的產(chǎn)生大致有兩種方法：一是用限制性內(nèi)切酶完全消化基因組DNA，這個方法有兩個特點。第一是假如所需的基因含有所用限制酶的識別位點，那么這一基因?qū)⒈豢寺≡趦蓚€或數(shù)個片段中，給研究帶來一定的困難。第二，一般常用的限制酶大多識別六個bp序列，切割DNA所產(chǎn)生的片段的平均大小相對比較小（約4kb即46＝4096bp），因此整個基因文庫要含有非常大量的重組體，這樣應(yīng)用分子雜交法進(jìn)行篩選就十分費(fèi)事費(fèi)時。雖然可以用限制酶進(jìn)行部分消化，產(chǎn)生約20kb的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。用于制備基因文庫的隨機(jī)片段的另一種方法是采用機(jī)械隨機(jī)切割。這種方法可以制備大片段的DNA（用噬菌體λ作載體約20kb，以cosmid作載體約45kb），從而克服上述的兩處缺點。但是這種方法的不是之處是：所制備的片段的末端順序是隨機(jī)的，還必須經(jīng)過末端修復(fù)，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體ＤＮＡ進(jìn)行連接。用于基因文庫構(gòu)建的載體常用噬菌體λ或cosmid載體，因為它們的容量比較大，可克隆大片段的DNA。雖然cosmid載體比λ載體的容量大，但由于文庫的保存λ比cosmid容易，因此λ載體用的更多些。Hae

、Alu文庫的大小(確定有足夠的克隆數(shù))必須包括一定數(shù)量的重組子才可能克隆基因組中的任何堿基序列。計算重組子數(shù)量的公式：N=ln(1-P)ln(1-f)P:重組體群體中出現(xiàn)目的基因的序列的幾率（一般期望99%）f:限制片斷的平均大小與基因組DNA總量之比N：一個完整基因文庫所應(yīng)包含的重組DNA的轉(zhuǎn)化子的克隆數(shù)Forexample:期望值為0.99，插入片斷為20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因組的克隆數(shù)的計算N

E.coli==1.1×103ln(1-0.99)ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)ln[1-(2×104/3×109)]這個例子說明用質(zhì)粒載體（插入片斷5-10kb）就可以建立很好的原核生物基因文庫，只需要幾千個克隆；而真核生物則需要更大承載能力的載體。有一些序列不能被克隆 Example:1.序列缺乏酶切位點;2.目的基因包容在一個其大小范圍超出載體承載能力的DNA片斷上

Toolongforthevectorused載體根據(jù)基因組的大小選擇合適的載體構(gòu)建DNA文庫。載體

PlasmidphageλcosmidBACYAC

插入片斷

(kb)523453501000最常用的載體是phageλ文庫構(gòu)建的載體與宿主

質(zhì)粒+大腸桿菌

λDNA+噬菌體其它:粘粒+大腸桿菌穿梭粘粒+大腸桿菌/酵母

YAC+酵母

BAC+大腸桿菌

TAC+大腸桿菌/農(nóng)桿菌基因組DNA文庫構(gòu)建實例DNA的提取DNA的純化,推薦CsCl密度梯度離心純化DNA的部分酶切

采用Sau3AⅠ(5’···^GATC···3’);完全酶切會產(chǎn)生相當(dāng)小的片段部分酶切會產(chǎn)生大小不一的片段,通過加入不同量的酶來控制部分酶切的程度部分酶切的目的:獲得盡可能多的長度在15-23kb之間的片段DNA片段的部分補(bǔ)平Sau3AⅠ酶切產(chǎn)生5’突出未端(4個堿基)應(yīng)用Klenow片段的聚合作用以dGTP,dATP為底物突出未端被部分補(bǔ)平,留下突出2個堿基的5’突出未端經(jīng)部分補(bǔ)平的DNA片段不再相互自連載體DNA的充分酶切和部分補(bǔ)平采用XhoⅠ充分酶切,留下5’突出未端(突出4個堿基)LambdaDNA經(jīng)酶切產(chǎn)生左臂(20kb),中間插入片段(14kb)和右臂(9kb)三個片段應(yīng)用Klenow片段的聚合作用以dTTP,dCTP為底物突出未端被部分補(bǔ)平,留下突出2個堿基的5’突出未端經(jīng)部分補(bǔ)平的載體DNA片段間不再相互自連部分補(bǔ)平的載體DNA與部分補(bǔ)平的酶切片段連接重組λDNA的包裝(packaging)

噬菌體由λDNA和蛋白質(zhì)外殼組成,離體條件下連接產(chǎn)生的重組λDNA可與商業(yè)公司提供的包裝蛋白組裝成有活性的噬菌體(phage)重組λDNA與包裝蛋白在22℃共保溫3h即完成包裝所有大小的DNA片段均可成功與載體連接,但只有大小居于15-23kb之間的片段與載體連接后方可包裝成有繁殖能力的噬菌體滴度測定(titering)

噬菌體溶液與大腸桿菌(LE392或KW251)溶液混和,37℃保溫30min后與45℃的Topagarose混和,鋪于LB平板上培養(yǎng)數(shù)小時至過夜后會出現(xiàn)噬菌斑,每個斑對應(yīng)于原先的一個噬菌體粒子文庫的效率以初始1μg基因組DNA所形成的噬菌斑數(shù)計算,單位為pfu/μgpfu:phagef