第五章 固定化酶和固定化細(xì)胞(下)新

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酶工程第五章固定化酶第一節(jié)概述第二節(jié)酶固定方法第三節(jié)微生物、植物、動物細(xì)胞的固定方法第四節(jié)固定化原生質(zhì)體和輔酶第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)第三節(jié)微生物、植物和動物細(xì)胞固定化

細(xì)胞特性比較固定化細(xì)胞的特點類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞生理狀態(tài)：死細(xì)胞（完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器）活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長期使用。概念：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。缺點：只適用于胞內(nèi)酶，而且細(xì)胞中的酶很多，可能產(chǎn)生副反應(yīng)，使產(chǎn)物不純。細(xì)胞膜和細(xì)胞壁對底物和產(chǎn)物的擴散也產(chǎn)生限制，降低了反應(yīng)速度。優(yōu)點：直接將微生物細(xì)胞固定化，不僅可以免去提純酶的步驟，而且酶處于天然環(huán)境，活力高，穩(wěn)定性好，還可利用細(xì)胞中的多酶體系，催化復(fù)雜的多步反應(yīng)。細(xì)胞固定化方法吸附法包埋法熱處理法：適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定，可與交聯(lián)法或其他固定法聯(lián)合使用。酶和細(xì)胞固定化示意圖吸附法主要通過載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。

包埋固定法

在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。包埋法分類常用載體：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺

常用凝膠包埋法舉例：海藻酸鈣包埋法

基本操作是：稱取一定量的海藻酸鈉配成水溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將冷懸液滴入一定濃度的凝固浴中（常用CaCl2溶液），形成球狀固定化細(xì)胞。通過改變載體溶液參數(shù)包埋細(xì)胞

改變載體溶液、操作溫度、鹽濃度、pH值和溶劑等參數(shù)時，亦可使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，將細(xì)胞包埋其中。研究熱點——光交聯(lián)樹脂包埋法

例：相對分子量為1000-3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外照射3min，就可制得。固定化死細(xì)胞（熱處理）：

對于耐熱性較好的酶，分離得到菌體后，經(jīng)過一定溫度熱處理后，使菌體內(nèi)的自溶酶系失活，細(xì)胞結(jié)構(gòu)固化，目的酶被固定的細(xì)胞內(nèi)。

此法比較簡單，不需要載體，也無需分離制取酶。耐熱性酶：耐熱性脂肪酶第四節(jié)固定化原生質(zhì)體和輔酶一、原生質(zhì)體的制備二、固定化三、舉例四、輔酶固定化一、原生質(zhì)體的制備將對數(shù)生長期的細(xì)胞收集——懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中——加入水解酶——分離——得到二、原生質(zhì)體固定化的方法將原生質(zhì)替制備好后，把離心收集到的原生質(zhì)體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中，配成一定濃度的原生質(zhì)體懸浮液，然后采用包埋法制成固定化原生質(zhì)體。三、輔酶固定化1原因有機輔因子中具有某些特殊的化學(xué)基團，參與酶的催化反應(yīng)有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生有機輔因子價格昂貴——工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機輔因子的保留和再生輔酶固定化的方法：2固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。3輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。

輔酶的固定化輔酶的固定化輔酶固定化的形式：第五節(jié)固定化酶的性質(zhì)

及其影響因素一、影響固定化酶性質(zhì)的因素二、固定化后酶性質(zhì)的變化三、評價固定化酶的指標(biāo)一、影響固定化酶性質(zhì)的因素1．酶本身的變化分子構(gòu)像的變化：主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。一、影響固定化酶性質(zhì)的因素2．載體的影響（1）位阻效應(yīng)（2）微擾效應(yīng)（3）分配效應(yīng)（4）擴散限制效應(yīng)3.固定化方法的影響二、固定化后酶性質(zhì)的變化1．固定化對酶活性的影響：酶活性下降，反應(yīng)速度下降原因：酶結(jié)構(gòu)的變化載體與酶活性中心重要氨基酸酶與底物空間位阻二、固定化酶的性質(zhì)酶固定化后，從游離狀態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合狀態(tài)，其性質(zhì)也隨之發(fā)生變化。具體有以下變化：（一）穩(wěn)定性增加：固定化酶穩(wěn)定性一般比游離酶有所提高。具體表現(xiàn)在以下幾個方面：1.熱穩(wěn)定性提高。2.使用穩(wěn)定性提高。半衰期一個月以上，具有工業(yè)應(yīng)用價值。3.保藏穩(wěn)定性提高。4.抗變性劑能力提高。5.抗蛋白酶水解。esp：固定化的酶可長時間連續(xù)使用，如包埋的乳酸脫氫酶在37℃下連續(xù)作用10小時不失活，而游離酶在同樣條件下作用2小時即失活90％。使用穩(wěn)定性提高可延長酶的使用壽命，降低成本。

esp：酶與載體結(jié)合后，可以長期保存。如游離的胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保藏4個月后殘留的活力只有2％，而偶聯(lián)于瓊脂糖后經(jīng)同樣處理可殘留82％的活力。這對酶制劑的貯存和運輸有重要意義。esp：將巨大芽孢桿菌青霉素?；腹潭ǖ骄郾╇胬w維載體上。將酶于0.05mol／L的磷酸緩沖液（pH7.5）中分別在不同溫度下保溫6小時，測定酶活力。固定化酶在50℃以下穩(wěn)定，天然酶在40℃以下穩(wěn)定。固定化酶的熱穩(wěn)定性優(yōu)于天然酶。1.固定化酶；2.天然酶

酶固定化后，抗變性劑（尿素、鹽酸胍、有機溶劑等）能力提高，甚至在一定條件下出現(xiàn)激活。固定化酶對蛋白酶的水解作用的抵抗力也比天然酶高。見下表：

殘留活力（％）

天然氨基與DEAE-纖維素與DEAE-葡聚糖酰化酶結(jié)合的酶結(jié)合的酶胰蛋白酶233387蛋白酶-P4853882、固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：a.固定化后酶分子與載體多點連接。b.酶活力的釋放是緩慢的。c.抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。（二）最適條件變化1.固定化酶的最適pH變化酶固定化后，對底物的最適pH和pH活性曲線常常發(fā)生偏移。一般說來，用帶負(fù)電荷載體（陰離子聚合物）制備的固定化酶，其最適pH值較游離酶偏高。反之，使用帶正電荷的載體其最適pH值向酸性偏移

pH對固定化前后天冬酰胺酶活力的影響1.固定化酶；2.游離酶pH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構(gòu)象（2）影響酶的催化基團的解離（3）影響酶的結(jié)合基團的解離（4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。pH對固定化酶的影響1）載體帶負(fù)電荷，pH向堿性方向移動。載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。

微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。pH的變化2）產(chǎn)物性質(zhì)對體系pH的影響催化反應(yīng)的產(chǎn)物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低。2.最適溫度變化固定化酶的最適溫度一般比游離酶高，提高的程度與載體性質(zhì)有關(guān)。如氨基酸?；腹潭ㄓ贒EAE-纖維素，最適溫度提高7℃，固定于DEAE-葡聚糖可升高12℃，達72℃。

一般溫度每升高10℃，反應(yīng)速度可提高1－2倍，所以固定化酶可在較高溫度下催化，從而加快反應(yīng)速度。而且在較高溫度下反應(yīng)還可避免微生物污染。（三）專一性的變化

催化小分子底物的酶固定化后專一性一般不變，但底物為大分子的酶，如淀粉酶、蛋白酶等，固定化后專一性可能發(fā)生變化。其產(chǎn)物可能與游離酶不同，應(yīng)用時需注意。

糖化酶用CM－纖維素疊氮衍生物固定后，相對分子質(zhì)量8000的直鏈淀粉的活性為游離酶的77％，相對分子質(zhì)量50000的只有17％。（四）相對活力的變化

固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專一性也能發(fā)生改變。例如、用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的3%，而對低分子底物保持不變。所以，一般認(rèn)為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。（五）米氏常數(shù)的變化固定化酶的Km與游離酶的Km有些變化，有些變化很大。使用載體結(jié)合法制成的固定化酶Km變化的原因，有時主要是載體與底物間的靜電作用的緣故。三、評價固定化酶的指標(biāo)1.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cm2）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。2.操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。連續(xù)測活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時間（t1/2）t1/2=0.693t/2.303log(E