第六章 診斷酶學(xué)

診斷酶學(xué)第六章酶是一類生物催化劑，指具有生物催化功能的高分子物質(zhì)。生物體內(nèi)含有數(shù)千種酶，它們支配著生物的新陳代謝、營養(yǎng)和能量轉(zhuǎn)換等許多催化過程，與生命過程關(guān)系密切的反應(yīng)大多是酶催化反應(yīng)。但是酶不一定只在細(xì)胞內(nèi)起催化作用。在酶的催化反應(yīng)體系中，反應(yīng)物分子被稱為底物，底物通過酶的催化轉(zhuǎn)化為另一種分子。第一節(jié)概述酶催化作用實(shí)質(zhì)：降低化學(xué)反應(yīng)活化能。蔗糖酶特點(diǎn)1．高效性：酶的催化效率比無機(jī)催化劑更高，使得反應(yīng)速率更快；2．專一性：一種酶只能催化一種或一類底物，如蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)水解成多肽。3．多樣性：酶的種類很多，迄今為止已發(fā)現(xiàn)約4000多種酶，在生物體中的酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于這個(gè)數(shù)量。4．溫和性：是指酶所催化的化學(xué)反應(yīng)一般是在較溫和的條件下進(jìn)行的。5．活性可調(diào)節(jié)性：包括抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反饋抑制調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)等。6．易變性：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)，因而會(huì)被高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等破壞；7．有些酶的催化性與輔助因子有關(guān)。酶與無機(jī)催化劑比較：1．相同點(diǎn)：1）改變化學(xué)反應(yīng)速率，本身幾乎不被消耗；2）只催化已存在的化學(xué)反應(yīng)；3）加快化學(xué)反應(yīng)速率，縮短達(dá)到平衡時(shí)間，但不改變平衡點(diǎn)；4）降低活化能，使化學(xué)反應(yīng)速率加快。5）都會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。2．不同點(diǎn)：即酶的特性，包括高效性，專一性，溫和性（需要一定的pH和溫度）等。酶的生理功能酶是人體內(nèi)新陳代謝的催化劑，只有酶存在，人體內(nèi)才能進(jìn)行各項(xiàng)生化反應(yīng)。人體內(nèi)酶越多，越完整，其生命就越健康。當(dāng)人體內(nèi)沒有了活性酶，生命也就結(jié)束。人類的疾病，大多數(shù)均與酶缺乏或合成障礙有關(guān)。細(xì)胞修復(fù)、消炎排毒、新陳代謝、提高免疫力、產(chǎn)生能量、促進(jìn)血液循環(huán)。。。?！敖衲甑闹Z貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給三名科學(xué)家，他們解決了生物學(xué)的一個(gè)重大問題：在細(xì)胞分裂時(shí)染色體如何完整地自我復(fù)制以及染色體如何受到保護(hù)以免于退化。這三位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者已經(jīng)向我們展示，解決辦法存在于染色體末端—端粒，以及形成端粒的酶—端粒酶?！薄?009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)--端粒和端粒酶伊麗莎白·布萊克本卡羅爾·格雷德杰克·紹斯塔克“攜帶基因信息的DNA線狀長分子擠壓形成染色體，端粒就像一頂高帽子置于染色體頭上。伊麗莎白-布萊克本和杰克-紹斯塔克發(fā)現(xiàn)端粒的一種獨(dú)特DNA序列能保護(hù)染色體免于退化?？_爾-格雷德和伊麗莎白-布萊克本確定了端粒酶，端粒酶是形成端粒DNA的成分。這些發(fā)現(xiàn)解釋了染色體的末端是如何受到端粒的保護(hù)的，而且端粒是由端粒酶形成的。”

“如果端?？s短了，細(xì)胞就會(huì)老化。相反，如果端粒酶的活動(dòng)顯著，端粒的長度也就能得以保持，并且細(xì)胞衰老也將延后。癌細(xì)胞就是一個(gè)例子，癌細(xì)胞被認(rèn)為是具有永久生命力的。相反，某些特定的遺傳疾病，會(huì)出現(xiàn)一些有缺陷的端粒酶這樣的特征，導(dǎo)致?lián)p害細(xì)胞。對此諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C給這一細(xì)胞基本機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)有助于新的治療措施的發(fā)展?！倍肆Ｃ付肆＃═elomere）是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。人端粒是由6個(gè)堿基重復(fù)序列（TTAGGG）和結(jié)合蛋白組成。沒有端粒，則DNA末端暴露，易被外切酶水解。端粒酶是一種由催化蛋白和RNA模板組成的酶，可合成染色體末端的DNA,賦予細(xì)胞復(fù)制的永生性。按照酶的化學(xué)組成可將酶分為單純酶和復(fù)合酶兩類。單純酶分子中只有氨基酸殘基組成的肽鏈，結(jié)合酶分子中則除了多肽鏈組成的蛋白質(zhì)，還有非蛋白成分，如金屬離子、鐵卟啉或含B族維生素的小分子有機(jī)物。

單純酶與結(jié)合酶結(jié)合酶的蛋白質(zhì)部分稱為酶蛋白，非蛋白質(zhì)部分統(tǒng)稱為輔助因子(cofactor)，兩者一起組成全酶(holoenzyme)；只有全酶才有催化活性，如果兩者分開則酶活力消失。非蛋白質(zhì)部分如鐵卟啉或含B族維生素的化合物若與酶蛋白以共價(jià)鍵相連的稱為輔基(prostheticgroup)，用透析或超濾等方法不能使它們與酶蛋白分開；反之兩者以非共價(jià)鍵相連的稱為輔酶(coenzyme)，可用上述方法把兩者分開。分類根據(jù)酶所催化的反應(yīng)性質(zhì)的不同，將酶分成六大類：1.氧化還原酶類促進(jìn)底物進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的酶類，是一類催化氧化還原反應(yīng)的酶，可分為氧化酶和還原酶兩類。2.轉(zhuǎn)移酶類催化底物之間進(jìn)行某些基團(tuán)（如乙?；?、甲基、氨基、磷酸基等）的轉(zhuǎn)移或交換的酶類。例如，甲基轉(zhuǎn)移酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)硫酶、激酶和多聚酶等。3.水解酶類催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶類。例如，淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶等。4.裂合酶類催化從底物（非水解）移去一個(gè)基團(tuán)并留下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)的酶類。例如，脫水酶、脫羧酶、碳酸酐酶、醛縮酶、檸檬酸合酶等。許多裂合酶催化逆反應(yīng)，使兩底物間形成新化學(xué)鍵并消除一個(gè)底物的雙鍵。5.異構(gòu)酶類催化各種同分異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體或光學(xué)異構(gòu)體之間相互轉(zhuǎn)化的酶類。例如，異構(gòu)酶、表構(gòu)酶、消旋酶等。6.合成酶類催化兩分子底物合成為一分子化合物，同時(shí)偶聯(lián)有ATP的磷酸鍵斷裂釋能的酶類。例如，谷氨酰胺合成酶、DNA連接酶、氨基酸：tRNA連接酶以及依賴生物素的羧化酶等。酶的活力酶活力單位（U，activeunit）：1個(gè)酶活力單位是指在特定條件（25℃，其它為最適條件）下，在1min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。比活:每分鐘每毫克酶蛋白在25℃下轉(zhuǎn)化的底物的微摩爾數(shù)。比活是酶純度的測量?；罨?將1mol反應(yīng)底物中所有分子由基態(tài)轉(zhuǎn)化為過渡態(tài)所需要的能量?；钚圆课?酶中含有底物結(jié)合部位和參與催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的氨基酸殘基部分?；钚圆课煌ǔＮ挥诘鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)域或亞基之間的裂隙或是蛋白質(zhì)表面的凹陷部位，通常都是由在三維空間上靠得很緊的一些氨基酸殘基組成?；钚詼y定初速度：酶促反應(yīng)最初階段底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度，這一階段產(chǎn)物的濃度非常低，其逆反應(yīng)可以忽略不計(jì)。米氏方程:表示一個(gè)酶促反應(yīng)的起始速度（υ）與底物濃度([s])關(guān)系的速度方程：υ=υmax[s]/(Km+[s])其中Km值稱為米氏常數(shù)，vmax是酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，[s]為底物濃度。米氏常數(shù):對于一個(gè)給定的反應(yīng)，使酶促反應(yīng)的起始速度（υ0）達(dá)到最大反應(yīng)速度（υmax）一半時(shí)的底物濃度(

Km=[s]），單位一般為mol/L，只由酶的性質(zhì)決定，而與酶的濃度無關(guān)。可用的值鑒別不同的酶。υ=υmax[s]/(Km+[s])Km值可近似的反映酶與底物的親和力大小：Km值大，表明親和力小；Km值小，表明親合力大。雙倒數(shù)圖:使1/v對1/[S]作圖，可以獲得一條直線。從直線與x軸的截距可以得到1/Km的絕對值；而1/Vmax是直線與y軸的截距。雙倒數(shù)圖直觀、容易理解，為酶抑制研究提供了易識(shí)別的圖形。

酶促反應(yīng)的影響因素及反應(yīng)條件的選擇(一)酶濃度酶促反應(yīng)速度與酶分子的濃度成正比。當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r(shí)，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。然而，當(dāng)酶濃度很高時(shí)，并不保持這種關(guān)系，曲線逐漸趨向平緩。根據(jù)分析，這可能是高濃度的底物夾帶有許多的抑制劑所致。病理情況下，酶濃度過高時(shí)，底物過早且過多被消耗，影響酶活性測定。

(二)底物的種類和濃度

在生化反應(yīng)中，若酶的濃度為定值，底物的起始濃度較低時(shí)，酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比，即隨底物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使在增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會(huì)增加，酶促反應(yīng)速度也不增加。研究酶的生理作用時(shí)，一般選擇Km最小的最適底物。臨床酶學(xué)測定時(shí)，先考慮有較高診斷價(jià)值的底物。一般酶測定時(shí)底物濃度最好為Km的10－20倍。

(三)緩沖液的種類、離子強(qiáng)度和pH酶在最適pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適pH，都會(huì)降低酶活性。主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：

①改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合；

②過高或過低的pH都會(huì)影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而使酶遭受不可逆破壞。

人體中的大部分酶所處環(huán)境的pH值越接近7，催化效果越好。但人體中的胃蛋白酶卻適宜在pH值為1~2的環(huán)境中，胰蛋白酶的最適pH在8左右。不同種類的緩沖液配制相同pH介質(zhì)所測酶活性并不相同。緩沖液的離子強(qiáng)度也影響酶的活性。各種體液樣品本身也是緩沖液，也會(huì)影響酶活性測定結(jié)果，一般樣品在總體積中的比例應(yīng)不超過10％。緩沖液中的物質(zhì)不應(yīng)與分析系統(tǒng)中的任何物質(zhì)反應(yīng)。(四)溫度

酶在最適溫度范圍內(nèi)，酶活性最強(qiáng)，酶促反應(yīng)速度最大。在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度每升高10℃，酶促反應(yīng)速度可以相應(yīng)提高1～2倍。不同生物體內(nèi)酶的最適溫度不同。

如，動(dòng)物組織中各種酶的最適溫度為37～40℃；微生物體內(nèi)各種酶的最適溫度為25～60℃酶的最適溫度與底物濃度、pH、離子強(qiáng)度、保溫時(shí)間等許多因素有關(guān)；測定酶活性推薦3種溫度；如250C，30℃和37℃。我國推薦溫度為37℃。酶制劑應(yīng)保存在冰箱中，取出后應(yīng)恢復(fù)至室溫立即應(yīng)用，以免發(fā)生變性。(五)激活劑與抑制劑能激活酶的物質(zhì)稱為酶的激活劑。激活劑種類很多，有①無機(jī)陽離子，如鈉離子、鉀離子、銅離子、鈣離子等；②無機(jī)陰離子，如氯離子、溴離子、碘離子、硫酸鹽離子磷酸鹽離子等；③有機(jī)化合物，如維生素C、半胱氨酸、還原性谷胱甘肽等。

許多酶只有當(dāng)某一種適當(dāng)?shù)募せ顒┐嬖跁r(shí)，才表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性，這稱為對酶的激活作用。而有些酶被合成后呈現(xiàn)無活性狀態(tài)，這種酶稱為酶原。它必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)募せ顒┘せ詈蟛啪呋钚?。抑制作用酶抑制作用是指酶的功能基團(tuán)受到某種物質(zhì)的影響，而導(dǎo)致酶活力降低或喪失的作用。該物質(zhì)即稱為酶抑制劑。酶抑制劑對酶有選擇性，是研究酶作用機(jī)理的重要工具。1.競爭性抑制作用：通過增加底物濃度可以逆轉(zhuǎn)的一種酶抑制類型。競爭性抑制劑通常與正常的底物或配體競爭同一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合部位。這種抑制使Km增大而υmax不變。2.非競爭性抑制作用:抑制劑不僅與游離酶結(jié)合，也可以與酶-底物復(fù)合物結(jié)合的一種酶促反應(yīng)抑制作用。這種抑制使Km不變而υmax變小。3.反競爭性抑制作用:

抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合而不與游離的酶結(jié)合的一種酶促反應(yīng)抑制作用。這種抑制使Km和υmax都變小但υmax/Km不變。臨床酶學(xué)測定中廣泛應(yīng)用金屬離子等激活劑來提高測定的靈敏度。在設(shè)計(jì)和選擇酶測定方法時(shí)，應(yīng)避免抑制劑對酶促反應(yīng)的影響。如脲酶測定，先通過透析、凝膠色譜或超濾等方法將尿中一些小分子抑制劑與酶分開。第二節(jié)血清酶一、血清酶的來源

1、血漿特異酶：作為血漿蛋白的固有成分，在血漿中發(fā)揮特定的催化作用的酶。如與凝血、纖溶有關(guān)的酶等。以酶原形式分泌入血。多數(shù)在肝臟合成，肝功能減退時(shí)，血漿中這些酶活性降低。另外：ChE（乙酰膽堿酯酶）、銅氧化酶(銅藍(lán)蛋白)、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)和脂蛋白酯酶等。

2、非血漿特異酶：

①外分泌酶：來源于消化腺或其他外分泌腺的酶。如胰淀粉酶、胰蛋白酶和前列腺酸性磷酸酶等。在血液中含量與相應(yīng)的分泌腺的功能及疾病有關(guān)。

②細(xì)胞酶：存在于各組織細(xì)胞中進(jìn)行代謝的酶類。隨著細(xì)胞的新陳代謝，有少量酶釋入血液。只有小部分來源于特定組織，有器官專一性。二、血清酶的去路

1．血清酶的半壽期：酶失活至原來活性一半時(shí)所需時(shí)間稱為酶的半壽期(T1／2)。代表酶從血中清除的快慢。2．血清酶的失活和排泄：酶主要是在血管內(nèi)失活或分解的。三、血清酶變化的病理機(jī)制

(一)酶合成異常

1．合成減少：肝損害時(shí)，如：血清中膽堿酯酶（ChE）常和清蛋白的濃度相平行;肝病時(shí)因卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）合成的減少而使血清中該酶濃度降低，并且比血清清蛋白的減少更為靈敏。酶基因變異，如肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?，血中銅氧化酶可明顯下降。

2．合成增多：增生性疾病，如骨骼疾病時(shí)，因成骨細(xì)胞增生，合成分泌更多的堿性磷酸酶（ALP）。惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞中酶的合成增加，如前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生大量酸性磷酸酶（ACP）。酶的誘導(dǎo)作用，如巴比妥類、乙醇藥物可誘導(dǎo)肝γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT）的合成，血清中的酶活性隨之增高。

(二)酶釋放增加

細(xì)胞酶的釋放的影響因素：

1．細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異：如肝細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LD）大于細(xì)胞外液的3000倍以上，紅細(xì)胞中此酶亦大于血漿的200倍。

非血漿特異酶，只要有少量細(xì)胞受損傷，酶從細(xì)胞中釋出，血液中酶明顯升高。

2．酶的相對分子量：各種酶從胞內(nèi)釋出的速度與酶的相對分子量成反比。

3．酶的組織分布：如臨床常用的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT）和肌酸激酶（CK）三種酶分別以心、肝和骨骼肌含量最豐富。含酶量高且血流豐富的組織器官，病變時(shí)可引起血清酶活性變化。

4．酶在細(xì)胞內(nèi)的定位和存在形式：線粒體中的酶不易從細(xì)胞中釋出，如谷氨酸脫氫酶（GLD）、線粒體型天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ASTm）及蘋果酸脫氫酶(MDm)。和結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合，或以多酶復(fù)合物的形式存在，較難釋出細(xì)胞。

(三)酶排出異常腎功能減退時(shí)，血清淀粉酶（AMY）活性升高;膽道梗阻時(shí)，血清ALP升高;很多疾病時(shí)血清酶增高的機(jī)制是多方面的，是多種因素綜合作用的結(jié)果。

四、血清酶的生理差異許多因素可引起人血清中某些酶濃度的生理性變化。如性別、年齡、飲食、鍛煉或日周期節(jié)律、人種、地理及其他環(huán)境因素等。應(yīng)注意生理差異對測定結(jié)果的影響。

1、性別：無差異，少數(shù)酶如CK、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶GGT，男>女。

2、年齡：血清中有些酶的活性常隨年齡而變化。

例：CK、LD；年齡引起酶變化最明顯的酶是ALP。

3、進(jìn)食：不受飲食影響，故不必空腹采血。高脂、高糖飲食后血清ALP活性升高。

酗酒可引起GGT明顯升高。

4、運(yùn)動(dòng)：肌肉中含量豐富的CK、LD、AST與運(yùn)動(dòng)量及持續(xù)時(shí)間有關(guān)，抽血前不宜過度運(yùn)動(dòng)。

5、妊娠與分娩：妊娠期某些酶升高，如銅氧化酶升高，分娩時(shí)，CK、CK-BB、AST、LD等升高。

6、其他：種族差異、與體重、身高的增長、體位改變、晝夜變化及家庭因素等有關(guān)。酶活性濃度的測定技術(shù)一、概述正常人血中大部分酶一般在pg到ng水平。常用的酶學(xué)測定方法：“酶活性濃度”。按監(jiān)測方法分類分為：量氣法、分光光度法、熒光法和放射性核素法、電極法和其他方法。以分光光度法最為常用。

分光光度法：50年代起采用最大優(yōu)點(diǎn)：擴(kuò)大了測定范圍，波長范圍更寬。結(jié)合工具酶的偶聯(lián)反應(yīng)，應(yīng)用NAD(P)H和NAD(P)＋吸收光譜差異建立的測定各種脫氫酶活性濃度的方法，可應(yīng)用于各種血清酶活性的測定。自動(dòng)生物化學(xué)儀和配套用試劑盒。

熒光法和放射性核素法：熒光法或放射性核素法靈敏度較高，適用酶濃度很低的標(biāo)本。通過熒光光度計(jì)測定，根據(jù)熒光強(qiáng)弱的變化換算出酶的活性。例：還原型的NAD(P)H有強(qiáng)烈的熒光，所有以NAD(P)＋為輔酶的氧化還原酶類均可用熒光法進(jìn)行測定。

二、酶活性濃度的測定按反應(yīng)時(shí)間將酶活性濃度測定方法進(jìn)行分類，可分為：定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測法。

1．定時(shí)法：早期測定酶活性濃度的方法測定一段這段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，計(jì)算酶促反應(yīng)平均速度。

優(yōu)點(diǎn)：比較簡單，因測定時(shí)酶促反應(yīng)已終止，故比色計(jì)或分光光度計(jì)無需保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也不考慮對酶活性的影響。

缺點(diǎn)：無法知道整個(gè)酶促反應(yīng)中是否都是零級反應(yīng)。

2．連續(xù)監(jiān)測法：連續(xù)測定酶反應(yīng)過程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度。優(yōu)點(diǎn)：方法簡單，可將多點(diǎn)的測定結(jié)果連接成線，容易找到成直線的區(qū)段，觀察到是否偏離零級反應(yīng)，因而可選擇線性反應(yīng)期來計(jì)算酶活性，不需終止反應(yīng)。

三、連續(xù)監(jiān)測法測定酶活性濃度

(一)連續(xù)監(jiān)測法的種類

1．直接法：在不終止酶促反應(yīng)下，直接測定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH等，計(jì)算酶活性濃度。分光光度法應(yīng)用最廣泛，最成熟的一種

2．間接法：1）在原來反應(yīng)體系中加入一些試劑，只和酶反應(yīng)物迅速作用，產(chǎn)生可被儀器檢出的物質(zhì)變化，但同時(shí)不和酶作用，也不影響酶活性。例：是血清ChE的丁酰硫代膽堿測定法。

2）酶偶聯(lián)法：應(yīng)用最多，最廣泛的，即在原反應(yīng)體系中加入另一些酶試劑，所進(jìn)行的酶促反應(yīng)和被測酶反應(yīng)偶聯(lián)起來。(二)酶偶聯(lián)反應(yīng)最簡單(單底物反應(yīng)只有一個(gè)工具酶)模式為：被測定酶(Ex)催化的反應(yīng)稱始發(fā)反應(yīng)；產(chǎn)生被檢測物質(zhì)產(chǎn)物C(如NADH)的反應(yīng)稱為指示反應(yīng)，相應(yīng)的偶聯(lián)酶(第二個(gè)酶)酶稱指示酶(Ei)。

(三)干擾因素

1．其他酶和物質(zhì)的干擾：

2．酶的污染：因試劑用酶多從動(dòng)物組織或細(xì)菌中提取，易污染其他酶，如不除去將引起測定誤差。3．非酶反應(yīng)：4．分析容器的污染：5．沉淀形成：

四、工具酶在酶學(xué)分析中作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性濃度的酶。常使用酶偶聯(lián)體系測定，指示酶和輔助酶作為反應(yīng)系統(tǒng)中的試劑。

(一)常用工具酶及其質(zhì)量要求常用工具酶多為氧化還原酶類工具酶純度不必求過高，才能降低作為試劑的成本。但減少或避免干擾測定的副反應(yīng)。

(二)工具酶參與的指示反應(yīng)最常用兩類分光光度法：

1）利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過氧化氫(H202)，再加氧化發(fā)色劑比色；

2）利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)－NAD(P)H的正／逆反應(yīng)后，直接通過分光光度法或其他方法測定NAD(P)H的變化量。

六、酶活性濃度的單位

(一)酶活性單位慣用單位，國際單位，Katal單位

(二)酶活性濃度單位

酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。

1．表示方法：U／L

2．酶活性濃度單位的計(jì)算：利用標(biāo)準(zhǔn)管法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法或摩爾消光系數(shù)法進(jìn)行計(jì)算求取酶活性濃度單位。酶的免疫化學(xué)測定

(一)測定原理

RIA分：直接法：將放射性核素標(biāo)記的酶分子與相應(yīng)抗體作用產(chǎn)生沉淀，然后將沉淀分離并進(jìn)行定量測定。間接法：將樣品中無放射性的酶蛋白與放射性標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)酶共同對有限量的抗體進(jìn)行競爭，根據(jù)其競爭程度來定量樣品中的酶蛋白量。兩種表示結(jié)果：

1）用酶活性濃度單位：U／L；2）用質(zhì)量濃度單位，：直接用ng／ml或pg／L報(bào)告。臨床醫(yī)生應(yīng)注意報(bào)告方式不同所帶來的差異。

(二)免疫化學(xué)測定的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高，少量或痕量酶；②特異性高，不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、等的影響；③能測定不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如酶原或去輔基酶蛋白，或因遺傳變異合成無活性的酶蛋白的測定；④特別適用于同工酶的測定

局限性：①要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清；②測定步驟多，操作繁瑣；③測定成本高。同工酶及其亞型測定

一、概念

同工酶：催化功能相同而結(jié)構(gòu)不同的一類酶。同工酶是同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體?！皝喰汀保卜Q為同工型:某些酶或同工酶從組織進(jìn)入體液后，進(jìn)一步變化為數(shù)個(gè)不同類型。由于翻譯后修飾的差異所形成的多種形式的一類酶。二、分析方法臨床同工酶的分析:1）分離出某酶的各同工酶組分；2）測定酶的總活性和各同工酶或亞型組分的活性。

如人的血清中有乳酸脫氫酶（LDH），用電泳方法可將其分成五個(gè)區(qū)帶，表明LDH由五種不同的酶分子組成。在臨床上，分析病人血清中某種酶的同工酶變化可以起到輔助診斷作用。

乳酸脫氫酶同工酶電泳圖譜電泳法注意事項(xiàng)：用電泳法進(jìn)行同工酶分析時(shí)，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時(shí)，要注意巨分子酶的存在。形成原因主要有：①酶與免疫球蛋白形成的復(fù)合物；②酶與其他蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物；③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亞基自身聚合等。如臨床癥狀不明顯，血清酶活性不正常但臨床表現(xiàn)不典型，同工酶圖譜異常時(shí)要警惕血清中有無巨分子酶。

巨酶血清中有時(shí)可出現(xiàn)相對分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于正常酶分子的一些酶,通常稱為巨分子酶,簡稱為巨酶。巨酶因其分子量大,在體內(nèi)不易排出,也不易被巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而降解,又因其有較長的半衰期,故在血中存留時(shí)間較長,它的存在將會(huì)嚴(yán)重干擾臨床常規(guī)酶測定的正確性,極易造成對酶測定結(jié)果的錯(cuò)誤判斷和臨床誤診。近年來發(fā)現(xiàn),血清中某些巨酶具有重要的診斷價(jià)值,某些巨酶卻易導(dǎo)致臨床疾病的誤診。巨分子酶的研究是臨床診斷酶學(xué)的重要課題。鑒定巨分子酶的方法有以下幾種:瓊脂糖凝膠電泳(電泳時(shí)須同時(shí)做質(zhì)控血清以資對照)、柱層析法、超速離心法、酶活化能測定、熱失活試驗(yàn)、免疫學(xué)方法和電泳法結(jié)合進(jìn)行鑒定。

巨酶的鑒定方法熱實(shí)活試驗(yàn)利用酶和巨酶的耐熱性不同而將巨酶鑒定出來。如巨CK的鑒定,45℃20min,測定CK殘余活性,CK-BB、CK-MB幾乎完全失活,而巨CK不受影響;又如巨淀粉酶與正常淀粉酶,在45℃和25℃分別比較兩種血清淀粉酶的活性時(shí),由于溫度升高而活性增強(qiáng)者為巨淀粉酶。色譜法常用柱色譜，方法費(fèi)時(shí)繁瑣，不適合臨床同工酶常規(guī)檢測。免疫分析法同工酶的免疫化學(xué)性質(zhì)也不同。利用純化的同工酶免疫動(dòng)物制備特異性的抗血清?？乖瓫Q定簇不同的同工酶可用特異的免疫反應(yīng)來識(shí)別。應(yīng)用較多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。第三節(jié)

臨床常用血清酶、同工酶

及其亞型分析

臨床上根據(jù)酶濃度的變化用以輔助診斷。

若酶濃度變化由細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性變化引起，表示臟器或組織損傷；

若為細(xì)胞內(nèi)酶合成增加所致，提示組織再生、修復(fù)、成骨或異位分泌，或提示有惡性腫瘤的可能；

若為酶排泄障礙引起者說明有梗阻存在。酶譜：指同時(shí)測定的一組性質(zhì)不同的酶，通過比較各酶活性的變化，根據(jù)酶增高或減少的“譜型”做出診斷。

(1)心肌酶譜：簡單而有效的心肌酶譜由CK、CK-MB、CK-MB亞型或CK-MM亞型組成。

(2)肌酶譜：用于對骨骼肌疾病的診斷和監(jiān)護(hù)。可供選擇的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。若能再加CK-MM亞型則更為理想。

(3)肝酶譜：用來判斷有無肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷、肝內(nèi)外膽汁淤積等肝膽疾病。

（4）腫瘤酶譜：具有器官特異性的有ACP及其同工酶、ALP及其同工酶、γ-GT及其同工酶、AFU、AMY及其同工酶、LPS等；非器官特異性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。

（5）胰酶譜：主要用于急性胰腺炎的診斷和鑒別診斷。有AMY及其同工酶等。

一轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶。普遍存在于動(dòng)物、植物組織和微生物中，心肌、腦、肝、腎等動(dòng)物組織以及綠豆芽中含量較高。轉(zhuǎn)氨酶參與氨基酸的分解和合成。

此酶催化某一氨基酸的α-氨基酸轉(zhuǎn)移到另一α-酮酸的酮基上，生成相應(yīng)的氨基酸，原來的氨基酸則轉(zhuǎn)變成α-酮酸。檢測意義轉(zhuǎn)氨酶是人體肝臟這個(gè)“化工廠”正常運(yùn)轉(zhuǎn)過程中必不可少的“催化劑”，是肝臟的一個(gè)“晴雨表，肝細(xì)胞是轉(zhuǎn)氨酶的主要生存地。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、中毒、壞死等時(shí)會(huì)造成肝細(xì)胞的受損，轉(zhuǎn)氨酶便會(huì)釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶升高。在高等動(dòng)物各組織中，活力最高的轉(zhuǎn)氨酶是谷氨酸：草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷氨酸：丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）。GOT以心臟中活力最大，其次為肝臟；GPT則以肝臟中活力最大，當(dāng)肝臟細(xì)胞膜破裂損傷時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT釋放到血液內(nèi)，于是血液內(nèi)酶活力明顯地增加。

在臨床上測定血液中轉(zhuǎn)氨酶活力可作為診斷的指標(biāo)。如測定GPT活力可診斷肝功能的正常與否，急性肝炎患者血清中GPT活力可明顯地高于正常人；而測定GOT活力則有助于對心臟病變的診斷，心肌梗塞時(shí)血清中GOT活性顯示上升。轉(zhuǎn)氨酶(ALT，AST)及其同工酶AST同工酶：細(xì)胞質(zhì)(ASTs)、線粒體(ASTm)；ALT同工酶：細(xì)胞質(zhì)(ALTs)、線粒體(ALTm)；

組織分布：

AST含量：心>肝>骨骼肌>腎。

ALT含量：肝>腎>心>骨骼肌等。肝ALT多存在于胞質(zhì)，肝中AST多存在于線粒體。生理變異：變異不大。標(biāo)本的采集、處理和貯存：忌溶血，宜用血清，貯40C冰箱一周，活性無變化，忌冰凍。正常值：谷草轉(zhuǎn)氨酶GOT：0-37u/L谷丙轉(zhuǎn)氨酶GPT：0-40u/L

1、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT）—GPT

肝炎時(shí)血清ALT升高，與病情輕重相平行,是肝損傷的一個(gè)很靈敏指標(biāo)；ALT半壽期長，是判斷急肝恢復(fù)的一個(gè)好指標(biāo)。慢肝特別是慢性活動(dòng)性肝炎ALT常升高。重癥肝炎（大量肝細(xì)胞壞死）血中ALT僅輕度增高，臨終時(shí)明顯下降，但膽紅素進(jìn)行性升高，即“膽酶分離”。另外：膽石癥、膽囊炎、肝癌、有些藥物如異菸肼、利福平等ALT升高。

2、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)—GOT

在AMI時(shí)升高遲于CK，恢復(fù)早于LD，診斷價(jià)值不大。在肝中AST低于心肌，主要存在于線粒體中病變輕的肝病如急性肝炎ALT>AST慢性肝炎，肝硬化時(shí)，病變累及線粒體，AST>ALTAST／ALT比值正常約為1．15，急性肝炎時(shí)<1，慢性肝炎，比值升高，肝硬化，比值≥2．0。轉(zhuǎn)氨酶偏高首先：非病理性的升高一般在100以下其次，轉(zhuǎn)氨酶升高，有可能是其他疾病，并不一定都是肝臟疾病。比如心臟疾病、腎炎、膽囊疾病等等均可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶上升。

最后，轉(zhuǎn)氨酶與肝病嚴(yán)重程度并不完全平行，這就意味著，有可能你的轉(zhuǎn)氨酶只有幾十，但是你的肝病已經(jīng)很嚴(yán)重，也有些病人的轉(zhuǎn)氨酶高達(dá)2000多，但是肝損卻并不嚴(yán)重。二、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶及其同工酶

GGT谷胱甘肽+氨基酸γ-谷氨酰氨基酸+半胱氨酰甘氨酸

GGT為含SH基的糖蛋白，GGT主要存在肝細(xì)胞膜和微粒體上，參與谷胱甘肽的代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，與組織中氨基酸、肽的分泌吸收、合成過程有關(guān)。

組織分布：含量順序排列：腎、前列腺、胰、肝、脾、腸、腦等。血清中GGT主要來自肝。生理變異：年齡、妊娠影響不大，男性高于女性，酗酒GGT升高。標(biāo)本的采集、處理和貯存：較穩(wěn)定，室溫2天、4℃1周活性無變化，紅細(xì)胞中GGT含量