蛋白表達(dá)及純化

蛋白表達(dá)、純化

抗體制備應(yīng)用及ELISA間接法盧士強(qiáng)2010-11-18Part1:蛋白表達(dá)、純化蛋白表達(dá)流程目的基因cDNA表達(dá)宿主載體設(shè)計(jì)引物連接轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)表達(dá)蛋白純化鑒定保存

geneCell-freeBacterialYeastInsectMammalianHostExpressionSystemCharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoublingtimerapid(30min)rapid(90min)slow(18-24hrs)slow(24hrs)costofgrowthmediumlowlowhighhighexpressionlevelhighlow–highlow–highlow–moderateproteinfoldingrefoldingmayberequiredrefoldingmayberequiredproperfoldingproperfoldingN-linkedglycos.nohighmannosesimple,nosialicacidcomplexO-linkedglycos.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationnoyesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesprojectcostlowlowmiddlehigh一：大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個(gè)開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素(endotoxin)Vector二大腸桿菌表達(dá)載體的基本組成一個(gè)良好的大腸桿菌表達(dá)載體：復(fù)制起點(diǎn)(ori)多克隆位點(diǎn)。篩選標(biāo)記（抗菌素抗性基因、Tag、篩選標(biāo)記）控制和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細(xì)胞中表達(dá),它的編碼結(jié)構(gòu)必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動(dòng)子有效控制下。可使外源基因高水平表達(dá)的最佳啟動(dòng)子必須具備以下幾個(gè)條件1)強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上2)應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平3)應(yīng)該是誘導(dǎo)型的,能通過簡單的方式,使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物得以誘導(dǎo)。常用的大腸桿菌表達(dá)載體啟動(dòng)子：λ噬菌體的PL啟動(dòng)子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動(dòng)子色氨酸操縱子trp啟動(dòng)子pBR322質(zhì)粒的beta－內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子a:如果在克隆基因編碼區(qū)的3

末端之后，接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀過位于下游另一個(gè)啟動(dòng)子b:如果在啟動(dòng)子的上游部位放置一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子,那么由該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的克隆基因的轉(zhuǎn)錄便會(huì)被限制在最低本底水平。c:轉(zhuǎn)錄終止子還能增強(qiáng)mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物水平。d:在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。e:大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當(dāng)其后連上一個(gè)U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉(zhuǎn)譯終止效率便會(huì)得到進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)譯起始序列a:mRNA的5

末端之獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征,是決定mRNA轉(zhuǎn)譯起始效率的主要因素。b:在構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體時(shí),需認(rèn)真選擇有效的轉(zhuǎn)錄起始序列。c:未鑒定出通用有效的轉(zhuǎn)譯起始序列的保守結(jié)構(gòu)(KOZAKSEQUENCE)篩選標(biāo)記:其編碼產(chǎn)物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結(jié)構(gòu)(重組質(zhì)粒)是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞同任何一種目的啟動(dòng)子連接,其表達(dá)活性可作為檢測啟動(dòng)子功能的依據(jù)。β－半乳糖苷酶基因lacZ熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)Tag-目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基Xgene引物的設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)一對特異性引物。上游、下游引物引入酶切位點(diǎn)oligo6RNA提?。篢RNzol（附件）RT-PCR：附件1：DNAmarker；2：X基因擴(kuò)增產(chǎn)物圖1.1X基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物GenecloningYourdestinationvectorR1R2YourlinearizedvectorX基因R1R2+1.雙酶切目的基因和載體及切膠回收：附件目的基因保護(hù)堿基內(nèi)切酶1內(nèi)切酶2保護(hù)堿基2.連接轉(zhuǎn)化：附件3.雙酶切鑒定：附件4.測序：附件1：DNAmarker;2：重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切;3：空質(zhì)粒pET28a雙酶切圖1.3重組質(zhì)粒pET28-X雙酶切鑒定圖1.4X基因發(fā)生點(diǎn)突變(AGU→AGC)，但為同義突變（Ser）Proteinexpression檢測該重組質(zhì)粒在BL21中是否能被誘導(dǎo)表達(dá)，并確定在不同IPTG濃度和時(shí)間蛋白誘導(dǎo)效率的差異。挑單克隆菌落于7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml培養(yǎng)管中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（8-16h）。37C，1mMIPTG終濃度誘導(dǎo)蛋白。取700ul過夜搖菌加入7ml含有相應(yīng)抗生素LB培養(yǎng)液的50ml離心管中，于OD600＝0.4-0.6（1:100接種，37C培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌生長至OD600＝0.4-0.6約需2h）時(shí)加入終濃度為1mM的IPTG。誘導(dǎo)前在37C培養(yǎng)的菌液中取1ml未誘導(dǎo)的對照，按1ml菌液×OD600×100μl的比例(如1mlOD600為0.4的菌加40ulbuffer)加入2×上樣緩沖液，混勻，-20℃保存或直接上樣。根據(jù)蛋白分子量大小配置相應(yīng)濃度的SDS膠。（50KD蛋白10％或12％）誘導(dǎo)3-4h后收集菌液，取1ml樣品，測OD600，10000rpm，1min離心去上清后加入相應(yīng)體積的2×上樣緩沖液，vortex。將收集的菌液在水中煮5min，上樣10μl，120V電壓走濃縮膠，加電壓至150V進(jìn)入分離膠電泳，直到染料剛好走到膠底。取下膠，考馬斯亮藍(lán)染色至少30min（染液若是新配的，染20min就夠了），脫色液脫色。若急需看到結(jié)果，可以將膠在500ml蒸餾水中煮沸兩次即可看到條帶。IPTGinductionEvenintheabsenceofIPTG,thereissomeexpressionofT7RNApolymerasefromthelacUV5promoter.Thedegreeoftoxicitywillvaryfromproteintoprotein.pETsystemmanual,Novagen,11thEdition1：蛋白marker；2~9：分別用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)0、1、2、3、4、6、8、12h。圖1.6X蛋白表達(dá)條件：誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化1：0mmol/L；2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L；6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L；8：3.5mmol/L；9：5.0mmol/L。圖1.5X蛋白表達(dá)條件：IPTG濃度優(yōu)化X蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件優(yōu)化ProteinPurificationCharacterizefunction,activity,structureUseinassaysRaiseantibodiesmanyotherreasons...GuidelinesforproteinpurificationDefineobjectivesDefinepropertiesoftargetproteinandcriticalcontaminantsMinimizethenumberofstepsUseadifferenttechniqueateachstepDevelopanalyticalassaysAdaptedfrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACBasicschemeofproteinpurificationFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACProteinpreparation,extraction,clarificationCellgrowth,proteinover-expressionCelllysisRemovalofcelldebrisFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACProteinisolation,concentration,andstabilizationReversibleprecipitationwithsaltororganicmoleculesFrom:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACFractionalprecipitationofproteinsAddPrecipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitatecontaminantsPrecipitateproteinofinterestDiscardsupernatant,ResuspendproteinDiscardpelletAddPrecipitant,Centrifugation,Discardsupernatant,ResuspendproteinIntermediatePurificationLiquidchromatography(lowerresolution,lowercost)From:ProteinPurificationHandbook.AmershamBiosciences.18-1132-29,EditionACAnintroductiontoliquidchromatographyProteinsolutionappliedtoacolumnColumn=solidporousmatrix(stationaryphase)+liquid(mobilephase)ProteinsseparatedbasedondifferinginteractionswithstationaryandmobilephasesMobilephaseconditionscanbeadjustedtoincreaseordecreaseaffinityofproteinforstationaryphase(gradient)SizeexclusionchromatographyBiggerProteinsSmallerProteinsAffinityChromatographyAffinityChromatographyMostcommonly-usedchromatographytechniqueCanbeusedonproteinwithnaturalligandsOfteninvolvescovalentattachmentofaffinitytagtoproteinBecauseofuniquetag,providesrapid,specificcleanupinonechromatographystep*CanallowforautomationofproteinpurificationPopularSmallAffinityTagsTagMatrixElutingAgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,CobaltimidazoleorlowpH5-15HHHHHn