第3章 抗體制備

第三章抗體制備醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫教研室

教學(xué)目的掌握：顆粒性抗原的制備、可溶性抗原的制備熟悉：可溶性抗原的純化--鹽析法第一節(jié)免疫原的制備免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。免疫原：顆粒性抗原可溶性抗原半抗原性免疫原

一、顆粒性抗原細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞細(xì)菌抗原：菌體抗原鞭毛抗原寄生蟲(chóng)體抗原：蟲(chóng)卵

血細(xì)胞抗原制備細(xì)菌抗原制備:

多用液體或固體純培養(yǎng)物，經(jīng)集菌后處理。寄生蟲(chóng)和真菌抗原制備:

除用破碎法加工粗提外，大多要加以適當(dāng)純化。二、可溶性抗原1.組織細(xì)胞抗原的制備：高速搗碎法－組織搗碎機(jī)搗碎研磨法－用玻璃勻漿器或乳缽研磨（一）組織和細(xì)胞可溶性抗原的粗提組織和細(xì)胞成分混合抗原制備程序上清液澄清所用材料必須是新鮮或低溫保存的去除包膜或結(jié)締組織臟器進(jìn)行灌洗洗去血跡及污物NS內(nèi)含0.5g／LNaN3冷浴中組織剪碎裝入搗碎機(jī)筒內(nèi)高速粉碎制成組織勻漿液3000r／min×10min取上清液去除細(xì)胞碎片及微小組織離心2.細(xì)胞可溶性抗原的破碎

（1）超聲破碎法

（2）酶處理法

（3）反復(fù)凍融法

（4）表面活性劑處理法（1）超聲破碎法原理：利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞破碎特點(diǎn)：①操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間②多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎（2）酶處理法

常用酶類：溶菌酶（堿性環(huán)境）方法：EDTA--革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特點(diǎn)：①此法適用多種微生物；②作用條件溫和；③內(nèi)含物成分不易受到破壞；④細(xì)胞壁損壞的程度可以控制。（3）反復(fù)凍融法原理：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。方法：將待破碎的細(xì)胞置冰箱內(nèi)凍結(jié)，然后置室溫融化，如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀蝗谄?。特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞。（4）表面活性劑處理法原理：在適當(dāng)?shù)臏囟?、pH及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜的滲透性改變或使之溶解。應(yīng)用:①破碎細(xì)菌，且作用比較溫和②提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞（二）可溶性抗原的提取和純化1.超速離心法：差速離心法－低速和高速交替進(jìn)行密度梯度離心法－區(qū)帶離心法方法差速離心梯度密度離心2.選擇性沉淀法：

核酸去除法－氯化錳、魚精蛋白

鹽析法－硫酸銨、硫酸鈉有機(jī)溶劑沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇鹽析沉淀法原理：利用各種蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽溶液中有不同的溶解度。優(yōu)點(diǎn)：方便、有效、不影響蛋白質(zhì)活性應(yīng)用：抗原的初篩提取丙種球蛋白抗原的濃縮水溶性非離子型聚合物沉淀法常用的聚合物：聚乙二醇(PEG)、硫酸葡聚糖應(yīng)用：3%-4%PEG沉淀免疫復(fù)合物

6%-7%PEG沉淀IgM8%-12%PEG沉淀IgG12%-15%PEG沉淀其他球蛋白

25%PEG沉淀白蛋白3.凝膠層析法

樣品溶液緩慢流經(jīng)凝膠柱時(shí)，大分子短時(shí)間內(nèi)被洗脫出來(lái)；小分子物質(zhì)緩慢地流出分子篩柱；通過(guò)凝膠的分子篩作用,大、中、小三類分子彼此間較易分開(kāi)。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，但掌握不好，分離效果較差。SephadexG-200凝膠IgM白蛋白IgG4.離子交換層析法

原理：

利用帶電離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。離子交換纖維素交聯(lián)樹(shù)脂離子化細(xì)粉交聯(lián)葡萄糖瓊脂糖聚丙烯酰胺常用離子交換劑5.親和層析法

是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。特點(diǎn)：純化效率高，速度快，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化目的。★親和層析支持物的選擇：①非特異性吸附低；②液體流速快；③在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；④有合適豐富的化學(xué)基團(tuán)⑤有豐富的微，以增加結(jié)合容量?！锱潴w的選擇條件：①抗原或抗體必須單一特異性；②抗原與抗體具有較高的親和力；③配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)?！锟乖蚩贵w與支持物的結(jié)合：①活化：溴化氰；②接“手臂”：帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖、羧基瓊脂糖、溴乙酰瓊脂糖、重氮鹽衍生物瓊脂糖、疏基瓊脂糖。★親和層析條件的選擇：①封閉活性基團(tuán)②除去未結(jié)合和結(jié)合不牢的蛋白解脫劑：

3mol/L硫氰酸鉀（或鈉）、

0.1mol/LpH2.4甘氨酸緩沖液★（三）免疫球蛋白片段的制備：1.解離二硫鍵2.溴化氰裂解法3.酶裂解法三、半抗原半抗原（無(wú)免疫原性）

＋載體完全抗原（具免疫原性）機(jī)體抗體/致敏淋巴細(xì)胞

多肽、多糖、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些藥物以及其他化學(xué)物品等。1、載體的選擇①蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白②多肽聚合物：多聚賴氨酸③大分子聚合物：羧甲基纖維素聚乙烯吡咯烷酮2、半抗原與載體的連接方法①物理方法②化學(xué)方法碳化二亞胺法：R-NH=CH-R’

半抗原＋載體蛋白質(zhì)

攪拌1-2h

室溫24h透析除去未反應(yīng)的半抗原混合

人工免疫原戊二醛法:☆戊二醛是常用的帶有兩個(gè)活性基團(tuán)的雙功能聯(lián)接劑☆半抗原-NH2

載體蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-載體蛋白OHC-(CH2)3-CHO混合第二節(jié)免疫佐劑免疫佐劑（immunoadjuvant）：預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑,簡(jiǎn)稱佐劑（adjuvant）。一、佐劑的種類化合物生物制劑人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、polyI∶C、胞壁酰二肽、細(xì)胞因子、熱休克蛋白動(dòng)物的佐劑：弗氏佐劑弗氏佐劑(Freund,sadjuvant)：弗氏完全佐劑－羊毛脂與液體石蠟的混合物弗氏完全佐劑－弗氏不完全佐劑加卡介苗乳化方法：研磨法和攪拌混合法

作用大于不完全佐劑局部形成肉芽和潰瘍不能用于人體

弗氏完全佐劑弗氏佐劑(Freundadjuvant)液體石蠟完全乳化備用＋高壓滅菌加熱抗原弗氏不完全佐劑卡介苗羊毛脂鑒定一滴乳劑乳劑不散浮于液面水中混合細(xì)胞因子佐劑IL-1、IL-2、INF

、GM-CSF應(yīng)用:抗寄生蟲(chóng)免疫抗腫瘤免疫二、佐劑的生物學(xué)作用

1.增強(qiáng)抗原免疫原性，使免疫原持久2.增強(qiáng)對(duì)抗原反應(yīng)性，提高抗體產(chǎn)生效價(jià)3.引起或增強(qiáng)遲發(fā)型超敏反應(yīng)

三、佐劑的作用機(jī)制

1.改變抗原的物理性狀、延緩抗原降解、延長(zhǎng)停留時(shí)間、有助于APC對(duì)抗原的攝取。

2.活化APC，增強(qiáng)APC對(duì)抗原的加工和提呈

3.刺激淋巴細(xì)胞增殖分化，擴(kuò)大免疫應(yīng)答第三節(jié)多克隆抗體的制備及應(yīng)用目的：獲取高質(zhì)量抗體用于檢測(cè)抗原或抗體同時(shí)也為診斷性試驗(yàn)提供特異的診斷試劑

抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動(dòng)物，該動(dòng)物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體多克隆抗體天然抗原刺激多種B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的多種抗體的混合物。多克隆抗體的產(chǎn)生示意圖一、免疫動(dòng)物的選擇抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬的關(guān)系：種屬差異越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng)；動(dòng)物個(gè)體的選擇：適齡、健康、體重符合要求；抗原的性質(zhì)；二、抗原劑量的選擇

最常用的純化方式是提取抗血清中的特異性IgG或單價(jià)抗體。三、免疫程序免疫原的劑量免疫間隔時(shí)間免疫途徑四、采血方法頸動(dòng)脈采血法：家兔、綿羊、山羊心臟采血法：家兔、豚鼠、大鼠、雞靜脈采血法：家兔、山羊、綿羊眼球摘除法或斷尾法：小鼠五、抗血清的鑒定和保存

抗原的制備抗原的分離純化純化抗原的鑒定佐劑免疫動(dòng)物制備抗血清抗血清的鑒定、保存五、抗血清的鑒定及保存抗體效價(jià)和純度的測(cè)定抗體特異性的鑒定抗體親和力的鑒定抗血清的保存1.抗體效價(jià)和純度的測(cè)定

顆粒性抗原：凝集反應(yīng)

抗血清1:81:161:321:64

可溶性抗原：沉淀反應(yīng)

抗血清1:81:161:321:641:128N.S

抗原抗體效價(jià)的鑒定（雙向免疫擴(kuò)散法）

測(cè)定抗血清效價(jià)有兩種稀釋方法：

①稀釋抗血清

②同時(shí)稀釋抗原和抗血清（棋盤滴定）1.抗體效價(jià)和純度的測(cè)定可用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法鑒定純度，如出現(xiàn)多條電泳帶，即提示抗血清中雜蛋白較多，需近一步純化。3.親合力鑒定

粗抗原純抗原粗抗原純抗原粗抗原純抗原

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