醫(yī)學機能學實驗設計

醫(yī)學機能學實驗設計大綱實驗名稱：課題來源：自選設計班級：設計人員：設計日期：指導老師：基礎醫(yī)學實驗教學示范中心2014年制一、實驗設計的目的意義：實驗設計的目的意義，國內外研究現(xiàn)狀，存在的問題，解決問題的思路。目的與意義:復制膀胱癌模型，利用直接采用藥物灌注的的方法，比較研究鹽酸米托蒽醌與卡介苗的治療作用。本實驗的目的即在于探討鹽酸米托蒽醌與卡介苗膀胱灌注預防腫瘤復發(fā)的療效，為臨床上治療膀胱癌尤其在腫瘤復發(fā)方面提供一種新思路，具有十分重要的意義。國內外研究現(xiàn)狀：膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，臨床上可分為淺表型、侵襲型和轉移型，每種類型的治療方法完全不同。其中淺表型膀胱癌占70％～80％，大多采用手術切除或經(jīng)尿道電切術治療，可以獲得較好的近期療效。但是術后3—5年內復發(fā)率高達60％～90％，且多在術后1年內復發(fā)。膀胱內灌注是預防術后復發(fā)的最常用的手段，理想的膀胱內灌注藥，應具有對腫瘤細胞敏感性高，能在膀胱粘膜上皮迅速達到有效藥物濃度，毒副作用較輕的特點。目前，常用的灌注藥物有羥基喜樹堿、吡柔比星、鹽酸米托蒽醌、卡介苗等。羥基喜樹堿、吡柔比星價格昂貴，而鹽酸米托蒽醌與卡介苗價格低廉，適合我國大多數(shù)人群的經(jīng)濟狀況。結合本實驗的目的，即探討鹽酸米托蒽醌與卡介苗這兩種膀胱灌注藥物在預防膀胱癌復發(fā)療效中的比較，看哪一種灌注藥物更具有臨床使用價值。存在的問題：目前市場上卡介苗主要是一種用來預防兒童結核病的預防接種疫苗，接種后可使兒童產(chǎn)生對結核病的特殊抵抗力。目前國內外實驗研究表明其在腫瘤治療中也有一定良好的療效。相關實驗表明，相對分子質量超過200的物質易保留在膀胱內，鹽酸米托蒽醌的相對分子質量為444．49，大分子量的鹽酸米托蒽醌從膀胱吸收極少，減少了心臟毒性、骨髓抑制等副作用。但目前對于二者在預防膀胱癌復發(fā)療效方面的效果比較還未見大量資料證明。解決問題的思路：用物理化學的方法對雌性C57BL/6小鼠膀胱粘膜表面進行處理,簡便高效地建立小鼠正位表淺膀胱癌模型。對膀胱癌動物進行手術切除腫瘤之后分別行鹽酸米托蒽醌與卡介苗膀胱灌注治療，比較二者的療效。參考文獻：[1]張建春，李軍，朱峰，等．經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術后立即腔內灌注及定期灌注吡柔比星預防復發(fā)的療效觀察[J]．中國醫(yī)藥，2010，5(5)：431-432．[2]PasinE，JosephsonDY，MitraAP，eta1．Superficialbladdercanceranupdateonetiology，moleculardevelopment，classification，andnaturalhistory[J]．RevUrol，2008，10(1)：3l_43．[3]DalbagniG．Themanagementofsuperficialbladdercancer[J]．NatClinPractUrol，2007，4(5)：254-260．[4]朱峰，張艷，李建昌，等．吡柔比星與絲裂霉素膀胱灌注預防淺表性膀胱癌術后復發(fā)的療效對比[J]．中國醫(yī)藥，2008，3(12)：788-789．[5]YamanLs，YurdakulT，ZissisWP，eta1．Intravesicalmitoxafltroneforsuperficialbladdertumors[J]．Anti-cancerDrugs，l994，5：97．·[6]VolpeA，RacioppiM，SaccoE，eta1．Newtherapeuticalap—proachesfornonmuscleinvasivebladdercancer[J]ArchltalUrolAndrol，2008．12(4)：136—142．[7]UptonML，TangnerCH，PaytonME．Evaluationofcarbondioxidelaserablationcombinedwithmitoxanfoneandpiroxi—camtreatmentindogswithtransitionalcellcarcinoma[J]．JAmVetMedAssoc，2006，2(4)：549-452．[8]SchmeeckleKD，KimYW，SartorO．Substantialactivityofmi．toxantroneandpaclitaxelinaheavilypre-treatedmetastaticbladdercancerpatient[J]．JLaStateMedSoc，2008，160(1)：l7—18．[9]YoneyamaT，OhyamaC，ImaiA，eta1．Low—doseinstillationtherapywithbacilleCalmette—Gu6finTokyo172strainaftertransurethralresection：historicalcoho~study[J]．Urology，2008，71(6)：1161—1165．[1O]DemkowT，AlterA，WiechnoP．IntravesicalbacillusCalmette—Gu6rintherapyforT1superficialbladdercancer[J]．UrolInt，2008，8O(1)：74-79．[11]KimYJ，HaYS，KimSKeta1．Genesignaturesforthepredic—tionofresponsetobacilluscalmette-guerinimmunotherapyinprimarypTlbladdercancels[J]．ClinCancerRes，201016(7)：2131-2137．[12]TakedaT，KikuchiE，YugeK，eta1．DiscontinuanceofbacilleCalmeRe··Gu6fininstillationthempyfornonmuscle·-invasivebladdercancerhasnegativeefectontumorrecurrence[J]．U—rology，2009，73(6)：1318-1322．[13]HirayamaT，MatsumotoK，TsuboiT．AnaphylactoidpurpuraafterintravesicaltherapyusingbacillusCalmette—Guerinforsuperficialbladdercancer[J3．HinyokikaKiyo，2008，54(2)：127—129．二、實驗設計方案（實驗設計目標,擬解決的主要問題,實驗動物設計,實驗專業(yè)設計，實驗統(tǒng)計設計,實驗方法設計，可行性分析,預期結果，實驗設計工作時間安排）。（一）實驗設計目標，擬解決的關鍵問題設計目標：探討鹽酸米托蒽醌與卡介苗膀胱灌注預防腫瘤復發(fā)的療效，為臨床上治療膀胱癌尤其在腫瘤復發(fā)方面提供一種新思路，從而探討二者能否在臨床治療中成為較為理想的預防膀胱癌復發(fā)的膀胱灌注藥物。擬解決的關鍵問題：實驗模型的制備、對不同試驗藥物進行灌注的分組與實驗結果分析。（二）實驗設計1、實驗動物設計本實驗選用雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物。選用小鼠作為實驗動物，有以下優(yōu)點：（1）小鼠生長速度快，繁殖能力高，大多用于安全性實驗及營養(yǎng)與生長發(fā)育有關的研究。（2）廣泛用于藥理，毒理藥校等實驗。（3）小鼠平時表現(xiàn)溫順，其體積適中便于觀察和解剖。（4）C57BL/6小鼠是腫瘤學、生理學、免疫學、遺傳學研究中常用的品系，符合實驗設計。2、實驗專業(yè)設計選用雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物，手術切除腫瘤后分別給予鹽酸米托蒽醌與卡介苗膀胱灌注，觀察二者在預防膀胱癌復發(fā)中的療效。觀察小鼠白細胞介素一2(IL一2)、腫瘤壞死因子(TNF)水平、膀胱癌復發(fā)情況等實驗指標。3、實驗統(tǒng)計設計實驗統(tǒng)計設計中應始終貫徹隨機、對照、重復三大原則。（1）隨機：選取正常成年健康體重相近的雌性C57BL/6小鼠90只，將90只小組鼠按體重由小變大依次編號。具體方法：動物編號為1—90號，每實驗小組30只。三個實驗小組分別設為A、B、C三組，其中A組膀胱灌注卡介苗，B組膀胱灌注鹽酸米托蒽醌，C組為空白對照組不作處理。（2）對照：本組實驗做了空白對照和實驗對照，在前面的專業(yè)設計里已經(jīng)提及。（3）重復：本實驗采用的是每實驗小組有30只小鼠，具有一定的重復性。（4）統(tǒng)計數(shù)據(jù)收集：本實驗搜集計量資料，初步確定對各組實驗數(shù)據(jù)的比較分為實驗值和基礎值比較。表1尿液中IL一2和TNF水平比較(±s)組別灌注前灌注后IL-2(kU/L)TNF(ug/L)IL-2(kU/L)TNF(ug/L)A組B組C組表2三組動物膀胱癌復發(fā)率和生存率比較[n(％)]組別腫瘤復發(fā)率小鼠生存率A組（n＝30）B組（n＝30）C組（n＝30）（5）統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析三組小鼠在年齡、性別、發(fā)育情況、健康狀況等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)，具有可比性。本實驗也采用計量資料來測定各種指標的數(shù)值，所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差（±s）表示，三組間實驗數(shù)據(jù)比較行完全隨機單因素方差分析。四組間實驗數(shù)據(jù)比較行完全隨機單因素方差分析，如各組肺系數(shù)總體均值的比較，其方法如下：（1）建立檢驗假設H0：==（各組肺系數(shù)總體均值相等）。H1：、、不等或不全相等，α＝0.05。（2）計算統(tǒng)計量統(tǒng)計學處理應用SPSS13．0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。(3)查F值表，確定P值，得出結論。4、實驗方法設計雌性C57BL/6小鼠實驗技術路線雌性C57BL/6小鼠 C組B組A組C組B組A組酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建實驗動物模型酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建動物模型酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建動物模型酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建實驗動物模型酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建動物模型酸堿腐蝕的方法處理膀胱粘膜，構建動物模型手術切除腫瘤手術切除腫瘤手術切除腫瘤手術切除腫瘤手術切除腫瘤手術切除腫瘤鹽酸米托蒽醌膀胱灌注卡介苗膀胱灌注不作處理鹽酸米托蒽醌膀胱灌注卡介苗膀胱灌注不作處理 實驗技術方法（1）隨機抽樣：隨機選取雌性C57BL/6小鼠90只，并分別編號，再隨機平分成三組，并稱重。（2）實驗分組：實驗分A、B、C三個小組。（3）模型復制：將雌性C57BL/6小鼠(6-8周齡)經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后,用改造過的靜脈留置針經(jīng)小鼠尿道插入膀胱腔內,用酸(HCL)堿(NaOH)腐蝕的方法對小鼠膀胱粘膜預處理，用PBS沖洗3遍后將0.1mLMB49(106個)灌注入膀胱,留置導管2小時左右,構建小鼠正位表淺膀胱癌模型。（4）實驗手術：所有小鼠觀察一般情況(精神狀態(tài)、飲食、體重等)和腫瘤生長情況(是否成瘤、腫瘤大小、有無血尿、遠處轉移等)。按計劃切除小鼠膀胱內相應腫瘤。（5）處理措施：對切除膀胱內腫瘤的小鼠分別進行鹽酸米托蒽醌與卡介苗膀胱灌注，其中A組膀胱灌注卡介苗，B組膀胱灌注鹽酸米托蒽醌，C組為空白對照組不作處理。術后2d起行膀胱灌注，每天1次，持續(xù)灌注1周。灌注前對小鼠禁水12h并放置尿管，排盡尿液后進行灌注。鹽酸米托蒽醌組：鹽酸米托蒽醌12mg+生理鹽水4OmL，經(jīng)導尿管注入膀胱?？ń槊缃M：每次生理鹽水50mL+卡介苗120mg。要求每15min改變小鼠體位1次，按順序仰臥位、左側臥位、俯臥位、右側臥位共2次min；使藥物和膀胱各壁充分接觸，要求藥液在膀胱內存留2h以上方可拔出導尿管或排尿。（三）可行性分析:1小鼠易得到，容易飼養(yǎng)，在科研工作中被廣泛利用。且本實驗中建立的動物模型其生物學特性與人的膀胱腫瘤生物學特性極為相似,是淺表性膀胱癌防治研究尤其是經(jīng)尿道治療和(或)免疫治療研究中理想的動物模型。2、常用的灌注藥物一般價格昂貴，而鹽酸米托蒽醌與卡介苗價格低廉，可從市場上購買。3、手術器材和設備均為實驗室常用，手術方法我們也相對熟練。（四）預期效果:1、