沉淀分離技術

沉淀分離技術第三章PrecipitationTechnology沉淀的目的通過沉淀達到濃縮的目的通過沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分沉淀可以將已純化的產品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進一步處理沉淀是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程?！?.1沉淀法概述沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質或有選擇地沉淀所需成分。生物分子在水中形成穩(wěn)定的溶液是有條件的，這些就是溶液的各種理化參數(shù)。任何能夠影響這些條件的因素都會破壞溶液的穩(wěn)定性。沉淀法就是采用適當?shù)拇胧└淖內芤旱睦砘瘏?shù)，控制溶液的各種成分的溶解度，從而將溶液中的欲提取的成分和其它成分分開的技術。AddYourTitleAddYourTitleAddYourTitle.加入沉淀劑沉淀劑的陳化促進粒子生長離心或過濾收集沉淀物沉淀法操作步驟：加沉淀劑的方式和陳化條件對產物的純度、收率和沉淀物的形狀都有很大影響沉淀能否發(fā)生沉淀劑或沉淀條件下對活性結構是否有破壞作用沉淀劑是否容易除去沉淀劑是否對人體有害沉淀過程應考慮的問題沉淀技術分離生化產物的典型例子是蛋白質的分離提取

優(yōu)點：設備簡單、成本低、原材料易得、便于小批量生產；

缺點：所得沉淀物可能聚集有多種物質，或含有大量的鹽類，或包裹著溶劑，產品純度常比結晶法低，過濾也較困難。eg.從血漿中通過5步沉淀生產純度高達99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。圖1利用蛋白質沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝流程圖沉淀法分離蛋白質的特點：生產前期可使原料液體體積很快減小10~50倍，從而簡化生產工藝、降低生產費用；使中間產物保持在一個中性溫和的環(huán)境；可及早將目標蛋白從其與蛋白水解酶混合液中分離出來，避免蛋白質的降解，提高產物穩(wěn)定性；用蛋白質沉淀法作為色譜分離的前處理技術，可使色譜分離使用的限制因素降低到最少?！?.2蛋白質的溶解特性蛋白質的溶解行為是一個獨特的性質，由其組成、構象以及分子周圍的環(huán)境所決定。蛋白質在自然環(huán)境中通常是可溶的，所以其大部分是親水的，但其內部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白質比起在化學上類似的大分子蛋白質更易溶解。蛋白質是兩性高分子電解質，主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質立體結構的外表面。水分子在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區(qū)大，疏水性強。蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成疏水區(qū)（憎水區(qū)）親水區(qū)荷電區(qū)蛋白質性質溶液性質分子大小溶劑可利用度（如：水）氨基酸組成

pH值氨基酸序列離子強度可離子化的殘基數(shù)溫度極性/非極性殘基比率極性/非極性殘基分布氨基酸殘基的化學性質蛋白質結構蛋白質電性化學鍵性質表1影響蛋白質溶解度的參數(shù)水化層蛋白質周圍的水化層可以使蛋白質形成穩(wěn)定的膠體溶液電荷蛋白質分子間靜電排斥作用防止蛋白質凝聚沉淀的屏障：§3.3蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團的電離。因溶液是電中性的，水中應有等當量的反離子存在。蛋白質表面的電荷與溶液中反離子的電荷構成雙電層。蛋白質分子蛋白質分子靜電斥力范德華引力顆粒間的相互作用偶極力色散力誘導力顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度在低離子強度時，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢，可看為一個凝聚的勢壘在高離子強度時，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能DLVO理論高離子強度低離子強度雖然這個理論所假定的條件并不完全適合于蛋白質分子，但該理論對于理解破壞蛋白質溶液的穩(wěn)定性仍有很大幫助，同時還有助于針對具體蛋白質選擇最合適的沉淀劑及技術。DLVO理論顆粒間的相互作用的位能取決于離子強度。在低離子強度時，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢，可看為一個凝聚的勢壘；在高離子強度時，吸引力超過排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。雖然這個理論所假定的條件并不完全適合于蛋白質分子，但該理論對于理解破壞蛋白質溶液的穩(wěn)定性仍有很大幫助，同時還有助于針對具體蛋白質選擇最合適的沉淀劑及技術。其他沉淀法金屬沉淀法聚電解質沉淀法非離子型聚合物沉淀法§3.4蛋白質沉淀方法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法中性鹽鹽析法一、中性鹽沉淀法（鹽析法）鹽析：在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質（酶）等生物大分子物質在水溶液中的溶解度降低，產生沉淀的過程。1、鹽析的概念及過程概念缺點得到的樣品欲繼續(xù)純化，需花一定時間脫鹽優(yōu)點①成本低，不需要特別昂貴的設備②操作簡單、安全③對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用早在1859年，中性鹽鹽析法就被用于從血液中分離蛋白質，隨后又在尿蛋白、血漿蛋白等的分離和分級中使用，得到了比較滿意的結果。鹽析鹽溶過程蛋白質在等電點時，容易互相吸引聚合沉淀。加入鹽離子后，破壞了吸引力，增加靜電斥力，使分子散開，溶解度增大？？？蛋白質和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2和－OH等親水基團，與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質分子周圍形成親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。2、中性鹽沉淀蛋白質的基本原理水化膜電荷親水膠體在水中的穩(wěn)定因素

++++++++++++++++等點電時的蛋白質（親水膠體）帶負電荷蛋白質（親水膠體）脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質聚集沉淀帶正電荷蛋白質（親水膠體）堿++水化膜帶正電荷蛋白質（疏水膠體）（1）破壞水化膜，分子間易碰撞聚集，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，于是蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，使蛋白質分子因熱運動碰撞聚集。（2）破壞水化膜，暴露出憎水區(qū)域,由于憎水區(qū)域間作用使蛋白質聚集而沉淀，憎水區(qū)域越多，越易沉淀。（3）中和電荷，減少靜電斥力，中性鹽加入蛋白質溶液后，蛋白質表面電荷大量被中和，靜電斥力降導致蛋白溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。選用鹽析用鹽的幾點考慮： 鹽析作用要強鹽析用鹽需有較大的溶解度鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經濟3、中性鹽的選擇陰離子：

檸檬酸根-3>酒石酸根-3>F->I03->H2P04->S04->CH3C00->Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS-陽離子：

Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+>Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+

Hofmeister對一系列離子沉淀蛋白質的能力進行排序，稱Hofmeister序列，或感膠離子序。常用于蛋白質沉淀的鹽為硫酸銨和硫酸鈉。硫酸鈉雖無腐蝕性但低于400C就不易溶解，因此只適用于熱穩(wěn)定性較好的蛋白質的沉淀過程。0℃20℃80℃100℃（NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101（1）溶解度大（2）分離效果好（3）不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質結構的作用。（4）價格便宜，廢液不污染環(huán)境。最常用的鹽：硫酸銨緩沖能力弱，具腐蝕性，含N缺點優(yōu)點（1）加入固體鹽法4、鹽析的操作方法適用：飽和度高，不增大溶液體積加入硫酸銨固體的量：查表、計算飽和度：

在給定條件下以可能達到的最大濃度的百分數(shù)表示的鹽濃度。以硫酸銨為例：25℃時，硫酸銨的飽和溶解度是767g/L，定義為100%飽和度查表法查表時注意溫度不同量的硫酸銨溶解時會引起溶液體積的變化計算法20℃25℃g：每升溶液加入固體硫酸銨的質量S2：所需達到的硫酸銨飽和度S1：原溶液的硫酸銨飽和度

（2）加入飽和溶液法適用：蛋白質溶液體積不大，所需調整的硫酸銨濃度不高。V：所需加入的飽和硫酸銨溶液的體積；V0：原溶液體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；S1：原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時達100％飽和度。優(yōu)點硫酸銨濃度變化連續(xù)，鹽析效果較好。缺點硫酸銨飽和度的測定、計算工作手續(xù)繁瑣，而且透析袋容積有限、鹽析速度慢、硫酸銨耗費大。（3）透析平衡法方法一：取料液分成等體積幾份，冷卻至0℃5、鹽析曲線的制作各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測定其中總蛋白和目標蛋白濃度（或測定離心上清液）以飽和度為橫坐標，沉淀（或上清液）中總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質溶解度曲線蛋白質量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％方法二各級均離心分離沉淀物，將沉淀溶于2倍體積的緩沖液中，測定其中總蛋白和目標蛋白濃度以飽和度為橫坐標，總蛋白和目標蛋白濃度為縱坐標，得到蛋白質溶解度曲線蛋白質量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％蛋白質量(mg)或酶活力硫酸銨飽和度％6、鹽析的影響因素（1）離子強度與離子類型S：離子強度為I時蛋白質的溶解度；S0：離子強度為0時蛋白質的溶解度；KS：鹽析常數(shù)。鹽析時，蛋白質溶解度與中性鹽的離子強度的關系：當溶劑的溫度一定時，對于某一溶質，S0是一常數(shù)，β（溶解度常數(shù)）

Cohn方程KS越大，有效成分溶解度隨鹽濃度增加而減小的程度越大。KS越大，分級范圍越小，鹽析效果越好。多價陰離子具有很高的KS，但高價陽離子的存在反而降低KS

；大而不規(guī)則的蛋白分子KS越大。KS主要取決于鹽的性質：離子價數(shù)離子半徑介電常數(shù)KS幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀>硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂1——纖維蛋白2——血紅蛋白3——擬球蛋白4——血清蛋白5——肌紅蛋白幾種蛋白鹽析時離子強度與溶解度的關系圖例3.1

溶菌酶在2.8mol/L和3.0mol/L硫酸銨溶液中的溶解度分別為1.2g/L和0.26g/L，試計算在3.5mol/L硫酸銨溶液中的溶解度。5.68×10-3g/L例3.2

有100L蛋白質溶液，其中含牛血清蛋白BSA和另一種雜蛋白X，質量濃度分別為10g/L和5g/L。擬用硫酸銨沉淀法處理該溶液以回收沉淀中的BSA。20℃下BSA和X的Cohn方程參數(shù)列于下表（假設其他蛋白質的存在不影響方程參數(shù)），其中離子強度用硫酸銨濃度（mol/L）表示。（1）忽略溶液體積的變化，若回收90%的BSA，需要加入多少固體硫酸銨？（37.27Kg）（2）沉淀中BSA的純度是多少？（95.34%）蛋白質βKsBSA21.67.65X20.06.85KS分段鹽析法Β分段鹽析法在一定pH、溫度條件下，改變離子強度。適用于早期粗提階段的分步分離。在一定離子強度下，改變pH、溫度。適于后期分離純化和精制。（2）蛋白質濃度硫酸銨鹽析法測定羧基肌紅蛋白：蛋白質濃度g/L硫酸銨飽和度%結果3058開始沉淀366開始沉淀306590%沉淀析出當?shù)鞍诐舛仍黾?0倍時，鹽析時所需硫酸銨的飽和度約減小7%。適宜蛋白質濃度是2.5％～3.0％（25mg/mL～30mg/mL）（3）pH的影響蛋白質所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質的帶電性質，因而就改變了蛋白質的溶解度。遠離等電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質時，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。在水或稀鹽溶液中測得的等電點與在高鹽溶液中測得的等電點結果可能不一樣注意（4）溫度的影響溫度是影響溶解度的重要因素，對于多數(shù)無機鹽和小分子有機物，溫度升高溶解度加大。但對于蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的。

在一般情況下，對蛋白質鹽析的溫度要求不嚴格，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。

1）注意飽和度表中規(guī)定的溫度；2）分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質濃度的變化；3）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心；4）加入硫酸銨時應注意攪拌，避免局部過濃；5）硫酸銨使用前須用H2S處理，高濃度的硫酸銨溶液使用前需用氨水或硫酸調節(jié)至所需pH。

7、注意事項蛋白質等電點沉淀法是基于不同蛋白質離子具有不同等電點這一特性，依次改變溶液pH值的辦法，將雜蛋白沉淀除去，最后獲得目標產物。二、等電點沉淀法（1）適用于疏水性強的蛋白質（2）中性鹽濃度增大時，等電點向偏酸方向移動，同時最低溶解度會有所增大。（3）無機酸通常價格便宜，無毒（4）蛋白質對低pH敏感，易失活未沉淀蛋白質的分率pH對大豆蛋白質溶解度的影響pH對白果堿提蛋白沉淀的影響利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質與金屬離子結合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調整PH值。由于許多蛋白質的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想。主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白例如：工業(yè)上生產胰島素粗提液調PH8.0調PH3.0去除堿性蛋白質去除酸性蛋白質胰島素三、有機溶劑沉淀法許多能與水互溶的有機溶劑如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低鹽濃度下沉淀蛋白質。加入溶劑后會使水溶液的介電常數(shù)降低，而使蛋白質分子間的靜電引力增大，導致凝集和沉淀。蛋白質的溶劑化，使原來和蛋白質結合的水被溶劑所取代，從而降低了它們的溶解度。有機溶劑可能破壞了蛋白質的某種鍵如氫鍵，使其空間結構發(fā)生某種程度的變化，致使一些原來包在內部的疏水基團暴露于表面并與有機溶劑的疏水基團結合形成疏水層，從而使蛋白質沉淀。機理分析進展對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。成本高。優(yōu)點缺點①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。2、有機溶劑的選擇和濃度的計算不同有機溶劑沉淀蛋白質的效率受多方面的影響，需通過試驗加以選擇。大致上以丙酮最佳，乙醇次之，甲醇更次。

前提：能與水互溶V=需加入100％濃度有機溶劑的體積V0=原溶液體積S1=原溶液中有機溶劑的濃度S2=所要求達到的有機溶劑的濃度離子強度3、有機溶劑沉淀的影響因素溫度樣品濃度pH值有機溶劑必須預先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度樣品穩(wěn)定的pH值范圍內，等電點附近通常溶液中鹽濃度以不超過5％為宜四、非離子多聚物沉淀法

20世紀60年代非離子型聚合物開始用于分離血纖維蛋白原和免疫球蛋白，從此高相對分子質量非離子聚合物沉淀蛋白質的方法被廣泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。①沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。②由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。③聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。非離子多聚物沉淀蛋白的原理①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當多的生物大分子。③沉淀后有機聚合物較難去除。特點：1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。方法聚電解質是含有重復離子化基團的水溶性聚合物，可用于蛋白質沉淀的聚電解質有聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、羧甲基纖維素和離子型多糖如肝素等。沉淀機理五、聚電解質沉淀法蛋白質分子的相反電荷與聚電解質結合，形成一個多分子絡合物，當絡合物超過游離蛋白質的溶解度極限值時，就發(fā)生沉淀。六、生成鹽復合物沉淀法金屬復合鹽法有機鹽法無機復合鹽法能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強烈結合的金屬離子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+；能與羧酸結合而不與含氮化合物結合的金屬離子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+；與巰基化合物強烈結合的金屬離子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。金屬離子沉淀蛋白質可分為三類：實際使用時，金屬離子的濃度常為0.02mol/L。Zn2+沉淀尿激酶有機鹽法無機復合鹽法含氮有機酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出，沉淀后用乙醚除去有機酸。如細胞色素C用45%硫酸銨除雜后，用20%TCA即可將其沉淀。如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等。可加入乙醚或采用離子交換除去無機鹽。七、其他沉淀法1、選擇性變性法酸堿變性熱變性表面活性劑變性有機溶劑變性選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質變性沉淀下來，而與目的物分開，這種分離方法就稱為選擇性變性沉淀法。變性過程符合一級動力學：用邊界條件（c=c0，t=0）積分得：c：蛋白質濃度c0：蛋白質初始濃度t：時間kD：變性速率常數(shù)，用阿累尼烏斯方程Z：頻率因子E：變性活化能R：氣體常數(shù)T：熱力學溫度例3.3

熱沉淀法處理兩種酵母脫氫酶A和B的混合液，A和B的熱變性速率常數(shù)分別為：試計算分別于20℃和50℃保溫10min后A和B的活性殘留率。2、親和沉淀利用蛋白質與特定的生物或合成的分子之間高度專一的作用而設計出來的一種特殊選擇性的分離技術，其沉淀原理是依據“吸附”有特殊蛋白質的聚合物的溶解度的大小。原理引導產生沉淀的方法有：離子交聯(lián)加入帶相反電荷的聚合物加入帶相反電荷的疏水基團改變pH值，誘導產生疏水沉淀溫度誘導產生沉淀配基-載體復合物與目的蛋白質的分離基本過程：親和結合洗滌初始階段：將一個目標蛋白質與鍵合在可溶性載體上的親和配體絡合成沉淀；所得沉淀物用一種適當?shù)木彌_溶液進行洗滌，洗去可能存在的雜質用一種適當?shù)脑噭⒛繕说鞍踪|從配體中離解出來§3.4核酸的沉淀方法核酸分離純化應維持在0-4℃的低溫條件下，以防止核酸的變性和降解。為防止核酸酶引起的水解作用，可加入十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-羥基喹啉、檸檬酸鈉等以抑制核酸酶的活性。有機溶劑沉淀法等電點沉淀法鈣鹽沉淀法溶劑沉淀法常用的沉淀分離法有：1、有機溶劑沉淀法由于核酸都不溶于有機溶劑，所以可在核酸提取液中加入乙醇、異丙醇或2-乙氧基乙醇，使DNA或RNA沉淀下來。核酸沉淀的形狀與其相對分子質量密切相關：相對分子質量>106Da的雙鏈DNA可以絲狀纖維纏繞在玻棒上；相對分子質量稍小的雙鏈DNA或單鏈DNA、RNA則以凝膠形式存在。這些核酸經離心后存在于沉淀中，用70%乙醇洗滌，除去其它鹽和小分子物質，干燥后即為核酸制品。2、等電點沉淀法脫氧核糖核蛋白的等電點為pH4.2；核糖核蛋白的等電點為pH2.0-2.5；tRNA的等電點為pH5。3、鈣鹽沉淀法核酸提取液10%氯化鈣鈣鹽形式1/5體積的乙醇DNA鈣鹽沉淀4、選擇性溶劑沉淀法①在核酸提取液中加入氯仿/異戊醇或氯仿/辛醇，振蕩一段時間，使蛋白質在氯仿/水界面上形成凝膠狀沉淀而離心除去，核酸仍留在水溶液中。②在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下，核酸的苯酚水溶液提取液中，DNA和RNA都進入水層，而蛋白質沉淀于苯酚層中被分離除去。③在DNA與RNA的混合液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNA而與留在溶液中的RNA分離。沉淀法應用利用蛋白質沉淀大規(guī)模提純蛋白與免疫球蛋白的工藝檸檬酸的生產萃取