植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展

20世紀70年代，人們開始研究植物轉(zhuǎn)讓。1970年,Morton等人關于鈣鹽處理大腸桿菌即能吸收外來DNA的發(fā)現(xiàn),奠定了磷酸鈣誘導外源基因的高效轉(zhuǎn)化。近幾十年,隨著高等植物的細胞培養(yǎng)、組織分化和再生,以及基因重組技術(shù)發(fā)展日趨成熟,植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應運而生。直到20世紀80年代初,轉(zhuǎn)基因矮牽牛和轉(zhuǎn)基因煙草獲得成功后,使植物基因工程發(fā)生了質(zhì)的飛躍,植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已得到廣泛應用和發(fā)展。它對于分子遺傳學研究和植物改良都具有特別重要的意義。許多帶抗性基因的植物,如抗病毒的煙草、抗蟲害的番茄、抗除草劑的大豆和玉米都已培育出來,使得向植物細胞導入外源基因培育作物新品種成為現(xiàn)實。目前用于植物細胞外源基因?qū)氲姆椒ê图夹g(shù)很多,應用時間較長、方法比較成熟的是土壤農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法。以植物病毒作為基因載體的外源基因轉(zhuǎn)化法,在一些植物中很有效,且方法簡便,轉(zhuǎn)化效率高。近年來,DNA直接導入法發(fā)展很快并且得到了廣泛應用。1操作指南1.1小麥農(nóng)桿菌誘導的基因轉(zhuǎn)導農(nóng)桿菌介導法是目前雙子葉植物基因轉(zhuǎn)移的常用方法。它是利用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti(Tumerinduce)質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobateriumrhizogenis)的Ri(Rootinduce)質(zhì)粒上的1段T-DNA區(qū)在農(nóng)桿菌侵染植物形成腫瘤的過程中,T-DNA可以被轉(zhuǎn)移到植物細胞并插入到染色體基因中。利用Ti質(zhì)粒的這一天然的遺傳轉(zhuǎn)化特性,可將外源基因置換T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受體染色體而獲得穩(wěn)定的表達。1979年,Marton等利用煙草的原生質(zhì)體與野生型的農(nóng)桿菌共培養(yǎng),從再生植株中檢測到LPDH活性。Zambryski等1983年在去除全部致瘤基因的T-DNA上插入外源DNA,轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株。1985年,Horsh等人首先創(chuàng)立了農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法(Leafdisctransformation),拓寬了農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化外源基因的受體范圍,可以直接利用植物的子葉、莖、芽、胚軸、未成熟胚,甚至成熟種子進行轉(zhuǎn)化。根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究最多,技術(shù)方法相對成熟的轉(zhuǎn)化途徑。但長期以來,用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移都局限在雙子葉植物范圍內(nèi)。直到近年來,用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物才取得了重大突破。有許多實驗已經(jīng)證明能夠用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物,如水稻、玉米和大麥等。農(nóng)桿菌的感染轉(zhuǎn)化具有明顯的優(yōu)勢,如轉(zhuǎn)基因多以單拷貝或低拷貝插入受體細胞,轉(zhuǎn)移相對較大的DNA片段,更有效地產(chǎn)生單位點整合,不易引起分之間或分之內(nèi)重排,遺傳穩(wěn)定,且得到的轉(zhuǎn)基因植株是可育的,操作簡單,成本低,轉(zhuǎn)化效率高,重復性好等。農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移一直是世界上的1道難題,Hessd等、Mooney等曾嘗試對農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥的可行性進行研究,未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。直到1997年,Cheng等才利用農(nóng)桿菌介導法獲得了有一定證據(jù)的小麥轉(zhuǎn)基因植株,夏光敏等也于1999年報道利用農(nóng)桿菌介導法獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株。目前,關于小麥農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)基因成功的報道很少,存在著轉(zhuǎn)化效率低,重復性差等缺點。人們擬對農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)環(huán)節(jié)進行仔細研究,以便建立比較成熟的轉(zhuǎn)化體系,促進小麥基因工程的進展。1.2外源基因序列病毒載體是最近新出現(xiàn)的一種用于植物轉(zhuǎn)化的載體。植物病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)是將外源基因插入到病毒基因組中,通過病毒對植物細胞的感染而將外源基因?qū)胫参锛毎Ｄ壳罢谘芯堪l(fā)展的植物病毒載體系統(tǒng)有3種:①單鏈RNA植物病毒載體系統(tǒng),是以單鏈RNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶作用合成雙鏈的cDNA,將其克隆到質(zhì)?；蛘沉］d體上,把外源基因插入到病毒的cDNA部分,通過體外轉(zhuǎn)錄,將帶有外源基因的病毒DNA感染并進入植物寄主細胞。Kozicl和Siegal于1984年首先應用煙草脆裂病毒(TRV)這種病毒載體系統(tǒng)。隨后,研究比較充分的雀麥花葉病毒(BMV)。有報道將人γ-干擾素克隆到BMV的RNA3的cDNA中,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄,與其他基因組RNA共感染煙草原生質(zhì)體,γ-干擾素的mRNA累積水平和表達水平都比用CaMV35s啟動子高5倍。1989年,Dawson用煙草花葉病毒(TMV)載體系統(tǒng)表達了CAT基因,發(fā)現(xiàn)其表達率非常高。②單鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng),是由單鏈環(huán)狀DNA分子組成,一般存在成對的2個病毒顆粒。這種二連基因組可以把外源基因插入其中1種DNA上而不影響另1種DNA基因組的復制。Ugaki等利用小麥矮縮病毒(WDV)的基因組為基礎構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒,轉(zhuǎn)到玉米胚乳原生質(zhì)體中,檢測到報告基因的表達。Hohn等則用玉米條紋病毒(MSV)載體系統(tǒng)研究玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。③雙鏈DNA植物病毒載體系統(tǒng),是將其病毒基因組中對病毒繁殖非必需的1段核苷酸序列去掉,換上1小段外源DNA而不影響病毒基因組正常包裝。用這樣重組的病毒載體感染植物細胞以獲得外源基因的轉(zhuǎn)移。目前研究和應用主要集中在花椰菜花葉病毒(CaMV),把二氫葉酸還原酶基因插入CaMV構(gòu)建穩(wěn)定重組病毒載體侵染蕪菁后,使蕪菁產(chǎn)生氨甲喋呤的抗性。另外用原倉鼠金屬硫基因的重組CaMV侵染植物,在感染的植物葉片中檢測到。綜上所述,這類載體比較小,便于在實驗中操作,而且這類載體只要與植物細胞共培養(yǎng)就可以較高地感染植物細胞,外源基因能在植物細胞中快速復制和高水平表達。但是病毒載體的容量有限,不能包裝大片段的外源DNA基因組,寄主范圍窄,復制穩(wěn)定性差,轉(zhuǎn)錄和復制機理復雜。故至今還沒有確定的證據(jù)表明,植物病毒是否可以整合進植物細胞的基因組中。有人認為轉(zhuǎn)入的外源基因穩(wěn)定遺傳的可能性不大。因此,目前植物病毒載體系統(tǒng)還未得到廣泛使用,但它仍然是植物轉(zhuǎn)化方面的一個重要領域。2dna直接導入法由于載體介導法所涉及的技術(shù)面廣,操作要求高,而且比較繁瑣,所以近年來DNA的直接導入法應用日益普及。DNA直接導入法用得最多的植物材料是原生質(zhì)體,另外還有植物器官分生組織、未成熟的胚、愈傷組織、細胞、花粉等。DNA直接導入法一般使用大腸桿菌的質(zhì)粒作為載體,也可以直接用外源DNA導入植物細胞。DNA直接導入法可分為:化學物質(zhì)誘導法、電激穿孔法、脂質(zhì)體法、顯微注射法、基因槍法、花粉管通道法等。2.1peg通過外源dna整合來制備ndf-t現(xiàn)在用得最多的物質(zhì)是聚乙二醇(polyetlcyleneglycol,PEG),它能與原生質(zhì)體融合,影響原生質(zhì)體膜的通透性,致使原生質(zhì)體較好地吸收外源DNA。PEG通過電荷之間的相互作用,與DNA形成緊密復合物,植物細胞通過內(nèi)吞作用吸收這些復合物。一般PEG濃度較低時,不會對原生質(zhì)體造成傷害,而獲得的轉(zhuǎn)基因植株來自同1個細胞,避免了產(chǎn)生嵌合轉(zhuǎn)化體,轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性和重復性好,但對原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生困難的植物難以利用,且轉(zhuǎn)化率低,一般在10-5～10-6。這種方法首先用在模式植物煙草上,轉(zhuǎn)導象Ti質(zhì)粒那樣比較大的質(zhì)粒。在添加PEG和外源DNA時,人們已成功地將外源基因整合到原生質(zhì)體基因組,并得到表達。利用原生質(zhì)體的全能性,目前此種方法已在多種禾谷類作物如水稻、大麥、玉米及一些雙子葉植物中獲得了轉(zhuǎn)基因植株。2.2細胞外源基因的激活電激穿孔法是20世紀80年代初發(fā)展起來的一種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。植物細胞膜在外界高壓電脈沖下會造成非對稱穿孔,這種在細胞膜上出現(xiàn)的短暫可逆性開放小孔,為外源基因提供了通道,DNA分子有可能通過小孔進入細胞內(nèi)并整合到受體細胞的基因組上,但細胞本身的生理活動受到的影響不大。由于質(zhì)膜具有可修復性,外加電壓造成的膜穿孔在一定時間內(nèi)可以自動修復,使細胞恢復到正常生理狀況。1985年,Michael等人首次利用高壓脈沖(1400V)處理使細胞質(zhì)膜產(chǎn)生可修復的穿孔,從而將外源基因轉(zhuǎn)入植物細胞,并在受處理的原生質(zhì)體培養(yǎng)2～4d后,檢測到外源基因的瞬時表達。自此,電激穿孔法先后在煙草、玉米、水稻、馬鈴薯、番茄、大豆、小麥等作物原生質(zhì)體上獲得成功。1986年,Morikawa等人進一步用帶壁植物細胞或組織,同樣實現(xiàn)了外源基因的轉(zhuǎn)移,使受體范圍進一步擴大。2.3雙乙酸熒光素分子的轉(zhuǎn)化脂質(zhì)體法是近年來才建立的一種轉(zhuǎn)化技術(shù),就是將包含外源基因的帶負電荷的脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體融合,從而達到轉(zhuǎn)基因的目的。Gregoriadis利用脂質(zhì)體介導生物大分子進入動物細胞。至今,脂質(zhì)體介導法已成為動物細胞轉(zhuǎn)化最為有效的手段。Cassells用脂質(zhì)體成功地將雙乙酸熒光素分子導入到番茄原生質(zhì)體中。直到Deshayes等用脂質(zhì)體介導法將帶有NPTⅡ基因的質(zhì)粒PLGVneo轉(zhuǎn)化煙草葉肉原生質(zhì)體,這是第1篇用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體,實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的成功報道。隨后,朱禎等用轉(zhuǎn)化脂將含有NPTⅡ的質(zhì)粒pIG3031導入水稻原生質(zhì)體,獲得外源基因在水稻細胞中正確表達的轉(zhuǎn)基因植株。表明脂質(zhì)體介導法有著廣泛的發(fā)展前景。脂質(zhì)體法一般分4個步驟,即原生質(zhì)體分離和純化,脂質(zhì)體的制備,原生質(zhì)體和脂質(zhì)體的融合以及轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)、篩選和鑒定。通常用作脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化的受體主要是原生質(zhì)體,而對于原生質(zhì)體培養(yǎng)比較困難的植物來說,這種方法就受到了限制,有待于進一步完善。2.4植物細胞外源dna的轉(zhuǎn)化顯微注射法是使用毛細微管在顯微鏡下將外源DNA注射入植物細胞或原生質(zhì)體的一種直接而完善的方法。這種方法最先用于動物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化。由于植物細胞的細胞壁和原生質(zhì)體的彈性,通常將細胞用瓊脂糖多聚賴氨酸固定,也可用吸管吸取單個細胞固定,然后將外源DNA通過特制的毛細微管注入細胞、原生質(zhì)體或直接注入核內(nèi)。1984年,Steinbiss等最早應用該方法將外源DNA注入植物原生質(zhì)體并實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)已用于多細胞系統(tǒng),如未成熟胚、懸浮細胞和分生組織等。2.5細胞受體改性基因槍法是1987年由美國康奈爾大學生物化學系Sanford提出,是指用鎢粉或金粉包裹外源DNA,而后依靠基因槍裝置,利用高壓氦氣沖擊波加速微彈去穿透植物細胞壁和細胞膜,使外源DNA進入植物細胞并整合到植物細胞染色體組中,從而達到穩(wěn)定遺傳和表達的目的。該方法對受體材料、耙細胞來源基本不受限制,細胞、組織、器官等均可作為受體用以轉(zhuǎn)化。目前通過基因槍技術(shù),很多植物都可以得到轉(zhuǎn)化,如小麥、水稻、玉米、大豆、棉花等。另外,基因槍技術(shù)還可以用來將外源基因轉(zhuǎn)化葉綠素和線粒體,從而使轉(zhuǎn)化細胞器成為可能,但用基因槍進行基因轉(zhuǎn)化也有其局限性。如轉(zhuǎn)化效率不高,基因插入往往是多拷貝的,常造成轉(zhuǎn)基因的失活或沉默,轟擊過程中可能造成外源基因的斷裂,使插入的基因成為沒有活性的片段,出現(xiàn)非轉(zhuǎn)化體或嵌合體的可能性較高,可能導致植物本身的某些基因非正常表達,還有可能發(fā)生共抑制現(xiàn)象。2.6粉后外源dna導入植物的技術(shù)早在1974年,我國科學家周光宇在觀察遠源雜交所產(chǎn)生的染色體水平以下的雜交現(xiàn)象后提出了DNA片段雜交的假設,并在此基礎上設計了自花授粉后外源DNA導入植物的技術(shù),即花粉管通道技術(shù)。此技術(shù)就是在植物授粉后,花粉在柱頭上萌發(fā)形成花粉管,使外源DNA沿著花粉管經(jīng)過珠孔通道進入胚囊,然后轉(zhuǎn)化成尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。利用這一技術(shù)可避免復雜的組織培養(yǎng)和原生質(zhì)體再生植株的困難,操作方便,而且節(jié)省時間、金錢,但工作量大。目前利用這種技術(shù)已成功地將外源DNA導入到小麥、水稻、玉米等植株中,在分子育種研究中具有廣闊的應用前景。2.7外源基因的轉(zhuǎn)化除上述的一些主要方法外,還有離子束介導法、超聲波介導法、激光微束穿孔法、萌發(fā)種子的電泳法、花粉管和種子浸泡法等。它們各有其優(yōu)缺點及適用范圍,對于特定的植物或在一定的條件下被證明是有效的。例如,1996年,程備久等用Ar+注入將比克氏棉和紅麻DNA導入泗棉2號;王蘭嵐、傅榮昭用YCAG激光儀轉(zhuǎn)化小麥京花1號獲得經(jīng)NPTⅡ酶活性分析及PCR-Southern檢測的轉(zhuǎn)基因植株。1994年,許寧等利用超聲波的空化作用誘導小麥幼胚獲得外源基因轉(zhuǎn)移。1993年,羅建沅利用種子浸泡吸漲以獲得轉(zhuǎn)基因酸漿植株。1991年,黃力全等用激光微束技術(shù)將外源基因?qū)胨緫腋∨囵B(yǎng)細胞取得成功。1990年,章力健用超聲波將外源基因直接導入小麥幼穗愈傷組織和煙草葉片獲得轉(zhuǎn)基因植株。3農(nóng)桿菌的誘導基因轉(zhuǎn)移法植物轉(zhuǎn)基因方法有很多種。植物轉(zhuǎn)基因的過程,不僅僅是外源DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞中去的過程,而是項綜合性的工作,包括外源基因的分離和克隆,外源基因?qū)胫参锛毎驮谥参锛毎型庠椿虻谋磉_及穩(wěn)定遺傳。由于要考慮到各種因素,選擇轉(zhuǎn)基因方法時必須仔細考慮。DNA直接導入法,對于穩(wěn)定的植物或在一定的條件下被證明是有效的,但它的1個主要不足之處是存在多變的DNA整合方式,而且DNA載體在植物細胞中會被切割或者重組、串聯(lián)化等。這些變化或修飾發(fā)生的頻率遠遠大于土壤農(nóng)桿菌的載體介導法。但在DNA直接導入法,載體構(gòu)建時,可以有目的地加入受體植物基因同源序列,從而通過同源重組,使外源DNA能插到事先確定的位點。另外DNA直接導入法導入外源基因的拷貝數(shù)較多,轉(zhuǎn)入頻率低,而多拷貝的外源基因在受體植物基因組上的排列