第四章 植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉2014

植物胚胎培養(yǎng)指對植物胚、子房、胚珠、胚乳進行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的培養(yǎng)方式。第四章植物胚胎培養(yǎng)及離體授粉一、胚培養(yǎng)的意義（應(yīng)用）1.促使發(fā)育不良和中途敗育的胚發(fā)育成熟（胚搶救）

高等植物的種間和屬間進行遠緣雜交時，由胚乳發(fā)育不良使雜種胚的敗育?？梢越⑴咛ヅ囵B(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上供應(yīng)與胚乳成分類似的外源營養(yǎng)，以保證胚的正常發(fā)育。2.打破休眠期促使萌發(fā)

胚培養(yǎng)可以克服種子發(fā)育上的障礙和促進胚的生長，提高發(fā)芽率、縮短育種周期或加速良種繁育。第一節(jié)胚培養(yǎng)3.克服多胚品種珠心胚的干擾

仙人掌、柑橘等，除正常有性胚外，還配以從珠心組織發(fā)生多個不定胚。這些不定胚常常侵入胚囊，使合子胚發(fā)育受阻，影響了育種效率。4.快速繁殖良種砧木

可以產(chǎn)生大量的次生胚，加速良種砧木的繁殖；而且胚胎發(fā)生技術(shù)是人工種子的重要基礎(chǔ)。5.誘導(dǎo)胚性愈傷組織

利用幼胚或胚軸，珠心組織等外植體，培養(yǎng)產(chǎn)生胚性愈傷組織，為細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離、融合，或遺傳轉(zhuǎn)化提供很好的材料。

6.種子生活力的測定

測定休眠的種子生活力，應(yīng)用一般的萌發(fā)試驗需時間很長，要預(yù)先進行后熟處理。

離體培養(yǎng)時間短。

7.稀有植物的繁殖

芭碧蕉是商品香蕉的一個野生親緣物種，其種子在自然條件下不能萌發(fā)，然而通過離體胚的培養(yǎng)很容易產(chǎn)生幼苗。作為一種異?，F(xiàn)象，有些椰子不能產(chǎn)生液體胚乳，而是一種肥厚的組織。由于十分罕見，價格非常昂貴，在菲律賓只有盛大宴會才供應(yīng)這種果實，這種椰子的種子也只能通過離體培養(yǎng)才能萌發(fā)。此外，通過胚胎培養(yǎng)，探討胚胎發(fā)育的機制、開展人工受精、以及胚與胚乳的相互關(guān)系等基礎(chǔ)研究。杜鵑——種子1.材料的消毒與接種種子——95%酒精消毒——選取完好種子——70%酒精浸數(shù)S——0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡——無菌水沖洗

——種子培養(yǎng)幾天——剝離種胚——接種在培養(yǎng)基上。2.培養(yǎng)基

成熟胚是含有根原基和莖原基以及1個或2個次生附屬子葉，培養(yǎng)時進一步發(fā)育產(chǎn)生根和莖，此時在營養(yǎng)上相對獨立，只需要提供簡單的營養(yǎng)條件，在含有大量元素的無機鹽和糖的培養(yǎng)基上即能生長。二、成熟胚的培養(yǎng)3.種胚培養(yǎng)的外界條件

光照：黑暗。

溫度：25℃溫度較適，但有些材料的生長需要較高的溫度，如熱帶蘭花的雜交種胚的培養(yǎng)，適于30℃溫度；具有休眠習(xí)性的植物種胚，接種后先在4℃溫度下，培養(yǎng)一段時間，然后轉(zhuǎn)入正常溫度培養(yǎng)。固體培養(yǎng)

原胚指未成熟的幼胚。其離體培養(yǎng)技術(shù)難度較大，越早期的胚，培養(yǎng)越困難。其分離需在顯微鏡下進行。

Hanning早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育，并且提前萌發(fā)形成小苗，這是世界上胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。三、原胚（幼胚）培養(yǎng)幼胚則要求更復(fù)雜的培養(yǎng)基。除了一般的無機鹽成分外，還要加入微量元素和生長輔助物質(zhì)，不同發(fā)育時期的幼胚對培養(yǎng)基成分要求不同，胚齡越小培養(yǎng)及成份越復(fù)雜。

對培養(yǎng)基營養(yǎng)的要求，認(rèn)為無機氮是以硝酸鹽、亞硝酸鹽或銨鹽的形式供給，

硝酸鹽比銨鹽好。培養(yǎng)基的滲透壓對幼胚的發(fā)育有密切的關(guān)系。通常培養(yǎng)基的滲透壓用蔗糖調(diào)整，也可以用甘露醇，用量在8％－12％左右（甚至18％），糖濃度過低還會引起胚早熟萌發(fā)．

幼胚不同發(fā)育時期對培養(yǎng)基滲透壓要求不一。

液體培養(yǎng)1.基本培養(yǎng)基（1）生長調(diào)節(jié)劑生長素與細胞分裂素合理搭配，才能控制胚性生長，促使胚發(fā)育成熟。

添加生長調(diào)節(jié)劑不當(dāng)，可能改變胚胎發(fā)育的方向，

轉(zhuǎn)向脫分化而形成愈傷組織，

或引發(fā)早熟萌發(fā)。（2）其他物質(zhì)氨基酸：谷氨酰胺等；維生素：必需。硫胺素、煙酸、泛酸等；

附加物：椰乳、香蕉、酵母提取物等天然有機物或活性炭。2.生長調(diào)節(jié)劑及其他附加物的影響

多培養(yǎng)基培養(yǎng)：外環(huán)，較簡單的培養(yǎng)基；中央，較復(fù)雜的培養(yǎng)基---接種幼胚。（異養(yǎng)——自養(yǎng)）

胚乳看護培養(yǎng)：培養(yǎng)基周圍放置同種或異種胚乳。胚柄的作用位于胚根一端，對幼胚的存活是關(guān)鍵，顯著刺激胚的進一步發(fā)育。3.培養(yǎng)方法4.培養(yǎng)過程幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)取材時期幼胚剝離培養(yǎng)條件的控制（是否需要特殊處理）

成熟或未成熟子房——70%酒精浸數(shù)S——0.1%升汞或飽和漂白粉浸10-30min——無菌水沖洗——剖出胚珠——取出完整胚——接種在培養(yǎng)基上。

一般采用液體培養(yǎng)法。

培養(yǎng)條件：

20-30℃，2000Lx，10-14hr1）按正常胚胎發(fā)育途徑形成植株（維持胚性生長）2）胚胎脫分化形成愈傷組織

多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織，再分化成胚狀體或形成芽苗。3）胚“早熟萌發(fā)”

幼胚不再發(fā)育，迅速萌發(fā)成幼苗。多數(shù)情況1個幼胚萌發(fā)成1個植株；有時因細胞分裂形成許多胚狀體，進而形成許多植株，即叢生胚現(xiàn)象。

“早熟萌發(fā)”產(chǎn)生畸形苗，或瘦弱發(fā)育不正常而死亡。這種畸形苗加以利用分離培養(yǎng)變異體，作為育種材料.5.

幼胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑胚乳培養(yǎng)的最早研究始于1933年，Lampe和Mills首例進行了玉米胚乳培養(yǎng)。到目前為止，已有40多種植物的胚乳進行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等近20種植物的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、葉等或得到愈傷組織。胚乳培養(yǎng)：將胚乳組織從母體上分離下來，通過離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。

裸子植物，胚乳是由雌配子體發(fā)育而成，是單倍體。被子植物，胚乳是雙受精的產(chǎn)物，是三倍體，因此可以獲得無籽果實。第二節(jié)胚乳培養(yǎng)1.胚乳外植體的制備1）胚乳較大塊組織的種子，如大戟科和檀香科的植物，可直接將種子表面滅菌，無菌條件下除去種皮即可培養(yǎng)。

2）帶果實的種子（斛寄生類），取授粉幾天后的幼果，表面滅菌后，無菌條件下切開幼果，取出種子，小心分離出胚乳，接種在培養(yǎng)基上。

一、胚乳培養(yǎng)方法（1）愈傷組織誘導(dǎo)

除少數(shù)寄生或半寄生植物可直接從胚乳中分化出器官，

大部分被子植物的胚乳，無論是未成熟的或成熟的，都需要經(jīng)歷愈傷組織階段，才能分化植株。胚乳接種后的6-10天后，不斷增生成乳白色團狀，成為愈傷組織。2.

胚乳愈傷組織誘導(dǎo)及形態(tài)建成生長旺盛的愈傷組織應(yīng)及時進行分化培養(yǎng)，此時需光。胚乳愈傷組織誘導(dǎo)器官的形成也可通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生2種途徑來實現(xiàn)。

通過胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株，最早的是柑橘。

通過胚胎發(fā)生途徑獲得再生植株的植物有檀香、橙、桃、棗、核桃和獼猴桃等。（2）形態(tài)建成

（3）3倍體后代的特征1）形態(tài)特征由于被子植物的胚乳是3倍體，因此，通過胚乳培養(yǎng)可得到3倍體植株，產(chǎn)生無籽果實；或由其加倍產(chǎn)生6倍體植株。

多倍體植株具有

粗壯、

葉片大而肥厚、葉色濃、

花大或重瓣、

果實大但結(jié)實率低的特征。這些變異性狀可直接利用或作為育種材料，尤其在花卉和藥用植物新品種選育方面往往有重要的利用價值。

胚乳愈傷組織及再生植株的染色體數(shù)常常發(fā)生變化。如蘋果（2n=34）胚乳植株根尖細胞染色體數(shù)的分布范圍是

29-56條，多數(shù)是37-56條，3倍體細胞只占2%-3%。同一植株是不同倍性細胞的嵌合體。染色體倍性混亂在胚乳培養(yǎng)中是相當(dāng)普遍的。但有些植株胚乳培養(yǎng)，如核桃、檀香、橙和柚等，其倍性表現(xiàn)出相對的穩(wěn)定性，這些植物的胚乳細胞往往也能長期保持器官的分化能力。2）胚乳再生植株的倍性胚乳植株染色體數(shù)目的檢查取胚乳培養(yǎng)植株根尖、幼葉或胚乳愈傷組織，

0.2-0.5%秋水仙素（或?qū)Χ缺斤柡腿芤海?5℃下處理4-8h，流水沖洗，

卡洛氏液或FAA固定（福爾馬林-酒精-醋酸混合固定液），

1mol鹽酸，60℃水浴下，水解10min，染色（1%醋酸洋紅，3-5min）、壓片（加1滴45%醋酸）、觀察。

胚乳的類型、胚乳愈傷組織發(fā)生的部位、培養(yǎng)基中外源激素的種類和水平。如獼猴桃來源于同一植株的胚乳，可以培養(yǎng)出三倍體和二倍體兩種倍性的植株。ZT3.0mg/L+NAA0.5mg/L，愈傷組織再生2倍體植株；ZT3.0mg/L+2,4-D1mg/L，愈傷組織再生3倍體植株；影響胚乳培養(yǎng)細胞染色體穩(wěn)定性的因素1.培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基在胚乳培養(yǎng)中，常用的基本培養(yǎng)基有White、LS、MS、MT等，其中以MS使用最多。生長調(diào)節(jié)劑：2,4-D、玉米素等；天然提取物：20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促進胚乳培養(yǎng)；蔗糖：小麥8%，枸杞5%。（2）培養(yǎng)條件

ph4.5-6.5；光照10-12h；溫度24-26℃。二、影響胚乳培養(yǎng)的因素胚乳培養(yǎng)中，通常有帶胚培養(yǎng)和不帶胚培養(yǎng)兩種方式。帶胚培養(yǎng)胚乳比不帶胚的胚乳組織容易形成愈傷組織。當(dāng)愈傷組織形成后，除去胚并不影響胚乳組織的增殖。2.

胚在胚乳培養(yǎng)中的作用被子植物胚乳的發(fā)生方式分為

核型（精核與極核受精后，只以核的分裂方式增殖）、

細胞型（精核與極核受精后，以細胞分裂方式增殖）、有的精核與極核受精后，有核分裂和細胞分裂兩種方式混生增殖。不論胚乳屬于核型或細胞型，處于發(fā)育早期的胚乳，其愈傷組織誘導(dǎo)率較低。

旺盛生長期是取材的最佳時期。幾種植物胚乳培養(yǎng)的最佳時間（授粉后天數(shù)）大麥10～12天；黃瓜7～16天；小黑麥7～14天。3.

胚乳發(fā)育類型和發(fā)育程度培養(yǎng)胚乳的首要目的是為了直接獲得三倍體植株。三倍體——六倍體——生產(chǎn)；倍性多樣性——篩選非整倍體植株；雜種胚乳——附加系和代換系——遺傳育種。

自1965年以來，許多植物通過胚乳培養(yǎng)獲得了3倍體幼苗和植株。

但被子植物中，培養(yǎng)的胚乳細胞以及得到的胚乳植株，并不都是三倍體。三、胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用附加系：正常染色體組添加了1或多條親緣種染色體的品系。代換系：正常染色體被異源種屬的1條或1對染色體代換后所形成的品系。

一、胚珠培養(yǎng)胚珠是種子植物的大孢子囊，是孕育雌配子體的場所，也是種子形成的前身。

分為受精胚珠和未受精胚珠。將胚珠從母株中分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以致形成幼苗的過程。第三節(jié)胚珠和子房培養(yǎng)（1）材料的選擇和滅菌

培養(yǎng)受精胚珠，摘取授粉時間合適的子房，如培養(yǎng)未受精胚珠，則在授粉前摘取子房。子房表面滅菌

剖開子房壁，取出胚珠或帶胚珠的胎座接種。（2）培養(yǎng)基對胚珠培養(yǎng)的影響培養(yǎng)基多為White、Nitsch、MS等，

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