第十七章+病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用

病理學(xué)常用技術(shù)的原理及應(yīng)用第一節(jié)大體與組織病理學(xué)技術(shù)

大體觀察—主要運(yùn)用肉眼或輔以放大鏡、量尺和磅秤等工具，對(duì)大體標(biāo)本及其病變性狀進(jìn)行細(xì)致的觀察和檢測(cè)。

組織和細(xì)胞學(xué)觀察—將病變組織制成切片染色，或脫落、穿刺細(xì)胞涂片染色，顯微鏡觀察。第二節(jié)組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)

（一）組織化學(xué)

一般稱特殊染色，通過應(yīng)用某些組織化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，顯示病變組織細(xì)胞的化學(xué)成分(如蛋白質(zhì)、酶類、核酸、糖類、脂類等），從而加深對(duì)形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝改變的認(rèn)識(shí)，弄清形態(tài)改變與代謝改變的關(guān)系。如過碘酸Schiff反應(yīng)（PAS）或區(qū)別骨Ewing肉瘤和淋巴瘤，前者胞漿內(nèi)含有糖原呈陽(yáng)性，后者陰性，磷鎢酸蘇木精染色可顯示橫紋肌肉瘤中瘤細(xì)胞胞漿中的橫紋。（二）免疫組織化學(xué)

是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測(cè)和定位組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)的一種技術(shù)，有較高的敏感性和特異性，能將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來，直接在組織切片、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位某些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)，結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)或激光掃描共聚顯微術(shù)等，對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。1、免疫組織化學(xué)染色方法

按標(biāo)記物性質(zhì)分：熒光法、酶法、免疫金、銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等。

按染色步驟分：直接法、間接法。

按結(jié)合方式分：抗原-抗體結(jié)合法、親和連接法、標(biāo)記的鏈親和素-生物素法等。2、免疫組化染色的質(zhì)量控制和結(jié)果陽(yáng)性表達(dá)方式：（1）胞漿陽(yáng)性（2）核周胞漿陽(yáng)性（3）胞漿局限性點(diǎn)狀陽(yáng)性（4）細(xì)胞膜陽(yáng)性（5）細(xì)胞核陽(yáng)性肌動(dòng)蛋白雄激素受體CD3-T細(xì)胞雌激素受體（ER）影響免疫組化染色質(zhì)量的因素：

取材及固定抗體質(zhì)量抗原封閉和修復(fù)技術(shù)操作3、免疫組化的應(yīng)用

大量商品化的單克隆和多克隆抗體出現(xiàn)、配套試劑盒的使用及方法學(xué)的不斷完善，使免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和病理外檢中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)手段之一。

免疫組化技術(shù)可用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)、細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究，激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)檢測(cè)，以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)也是非放射性原位雜交、原位PCR和原位末端標(biāo)記DNA片段等技術(shù)的基礎(chǔ)。第三節(jié)電子顯微鏡技術(shù)

透射電子顯微鏡是最早、最廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種電鏡，以后又相繼誕生了掃描電鏡、超高壓電鏡等。電鏡的使用大大地開闊了我們的視野，看清了細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)的各種細(xì)胞器和細(xì)胞核的細(xì)微結(jié)構(gòu)及其病理變化，并由此產(chǎn)生了亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)病理學(xué)，又稱超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)。電鏡技術(shù)的應(yīng)用

在生命科學(xué)領(lǐng)域可用于胚胎及組織發(fā)生學(xué)方面的研究和觀察；在臨床上可用于多種疾病亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)病變的觀察和診斷，特別是腎小球疾病及肌病的診斷，以及一些疑難腫瘤的組織來源和細(xì)胞屬性判定，如一些去分化、低分化或多向分化腫瘤的診斷和鑒別診斷；最早關(guān)于細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)描述也是源于電鏡的觀察。隨著電鏡技術(shù)的不斷發(fā)展，以及與其他方法的綜合使用，還出現(xiàn)了免疫電鏡、電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡圖像分析技術(shù)及全息顯微術(shù)等。電鏡技術(shù)也有其局限性，如電鏡設(shè)備昂貴、樣本制備較復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較高；另外，由于樣本取材少，觀察范圍有限，有時(shí)還可能會(huì)遺漏信息；當(dāng)用于輔助腫瘤外檢診斷時(shí)，只能判定組織或細(xì)胞的來源，不能確定腫瘤的良惡性。第四節(jié)原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

原位多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)的一部分，是在體外經(jīng)酶促反應(yīng)將某一特定DNA序列進(jìn)行高效、快速擴(kuò)增，它可將單一拷貝或低拷貝的待測(cè)核酸以指數(shù)的形式擴(kuò)增而達(dá)到常規(guī)方法可檢測(cè)的水平。原位PCR(insituPCR)技術(shù)是將PCR的高效擴(kuò)增與原位雜交的細(xì)胞及組織學(xué)定位相結(jié)合，在冷凍或石蠟包埋組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上來檢測(cè)和定位核酸的技術(shù)。原位PCR技術(shù)方法

原位PCR技術(shù)有直接法原位PCR、間接法原位PCR、原位反轉(zhuǎn)錄PCR和原位再生式序列復(fù)制反應(yīng)等方法，其中應(yīng)用相對(duì)較廣泛的是間接原位PCR方法。主要程序有組織固定、預(yù)處理(如蛋白酶K和RNA酶消化)、原位擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的原位雜交和檢測(cè)等。由于使用原位雜交技術(shù)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物作檢測(cè)，使該方法的特異性較直接法高。原位PCR技術(shù)的應(yīng)用及存在的問題

應(yīng)用：原位PCR技術(shù)能用于低拷貝的內(nèi)源性基因的檢測(cè)和定位，可用于基因突變、基因重排和染色體易位等的研究和觀察；還可用于外源性基因的檢測(cè)和定位，如對(duì)各種感染性疾病病原的基因檢測(cè)，如EB病毒、人乳頭狀瘤病毒、肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒和人免疫缺陷病毒基因組及結(jié)核、麻風(fēng)桿菌基因的檢測(cè)等；在臨床上還可用于對(duì)接受了基因治療患者體內(nèi)導(dǎo)人基因的檢測(cè)等。存在的問題：①特異性不高，特別是假陽(yáng)性的問題。產(chǎn)生的原因有引物與模板的錯(cuò)配、在擴(kuò)增中因細(xì)胞內(nèi)受損傷DNA的修復(fù)而形成的非特異性序列和特異性擴(kuò)增序列的彌散等。②技術(shù)操作復(fù)雜，影響因素太多。③需要特殊的設(shè)備，即原位PCR儀，價(jià)格昂貴。第五節(jié)核酸原位雜交

原位雜交是核酸分子雜交的一部分，是將組織化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合來檢測(cè)和定位核酸的技術(shù)。用標(biāo)記了的已知序列的核苷酸片段作為探針，通過雜交直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上檢測(cè)和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。其生物化學(xué)基礎(chǔ)是DNA變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。根據(jù)所選用的探針和待檢靶序列的不同，有DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交。探針的選擇和標(biāo)記

用于原位雜交的探針有雙鏈cDNA探針、單鏈cDNA探針、單鏈cRNA探針和合成的寡核苷酸探針等。探針的長(zhǎng)度以50-300個(gè)堿基為宜，用于染色體原位雜交的探針可為1.2～1.5kb。探針標(biāo)記物有放射性同位素如3H、35S、32p等，這類探針的敏感性高；非放射性探針標(biāo)記物有熒光素、地高辛和生物素等，其敏感性不如放射性標(biāo)記探針，但有性能穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、成本低和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。原位雜交的主要程序

實(shí)驗(yàn)材料：常規(guī)石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、細(xì)胞涂片和培養(yǎng)細(xì)胞爬片等。

主要程序：包括雜交前準(zhǔn)備、預(yù)處理、雜交、雜交后處理-清洗和雜交體的檢測(cè)等。

應(yīng)注意的問題：①DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交，需滅活RNA酶處理；使用雙鏈cDNA探針和/或待測(cè)靶序列是DNA時(shí)，需進(jìn)行變性處理使DNA解鏈；②雜交溫度應(yīng)低于雜交體的解鏈溫度(Tm)25度左右；③對(duì)照實(shí)驗(yàn)：有組織對(duì)照、探針對(duì)照、雜交反應(yīng)體系對(duì)照和檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照等，根據(jù)具體情況選用。

熒光原位雜交

可以用直接法或間接法進(jìn)行，直接法以熒光素