三種酒精性脂肪肝小鼠模型的建立及血清生化指標(biāo)分析

三種酒精性脂肪肝小鼠模型的建立及血清生化指標(biāo)分析

近年來，酒精性肝病的發(fā)病率逐年增加。酒精性肝炎是酒精性肝炎的早期病變，屬于可逆轉(zhuǎn)換的良性肝臟疾病1'。目前國內(nèi)外學(xué)者對酒精性脂肪肝的研究非常關(guān)注,但其發(fā)病機制尚不完全清楚,因此建立穩(wěn)定可靠、簡單易行的動物模型對研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尤為重要。小鼠因其體型小、操作簡便,而成為復(fù)制模型較為理想的實驗動物,但小鼠的品種品系較多,大量研究者［2－5］在使用不同品系小鼠復(fù)制酒精性脂肪肝模型時其實驗結(jié)果又盡相同。因此,本實驗選取BALB/c、C57和C3H三種常用的近交系小鼠,采用酒精灌胃法復(fù)制酒精性脂肪肝模型,并對其血清生化指標(biāo)和病理學(xué)改變進行綜合對比分析,以期從中選擇一種最佳實驗動物來建立酒精性脂肪肝模型,為今后研究酒精性脂肪肝疾病及其發(fā)病機制提供良好的實驗保障。1小鼠和實驗動物選擇近交系BALB/c、C57和C3H小鼠,均為SPF級,雄性,各20只,單鼠體質(zhì)量為20~22g,BALB/c小鼠和C57小鼠來自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】,C3H小鼠來自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證【SCXK(京)2011-0009】。本實驗室具有SPF級實驗動物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。1.2反應(yīng)劑量乙醇(分析純,純度>99.7%)(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20130315);生理鹽水(解放軍第302醫(yī)院制劑室提供,批號:130527405,石家莊四藥有限公司);小鼠飼料(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心飼料室),生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0003】。1.3灌胃、造模方法及劑量各品系小鼠均在本實驗室SPF級屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng),動物自由飲水采食,3d后將各品系小鼠隨機分為對照組(n=10)和模型組(n=10)。造模方法:各組小鼠每日給予50%乙醇灌胃,灌胃量為12mL(kg·bw),折合乙醇的劑量為4.8g/(kg·bw)［6］,持續(xù)30d,小鼠正常飲水采食鼠蛋料。對照組給予等量的生理鹽水灌胃。1.4小鼠血清生化指標(biāo)檢測造模過程中每天觀察各組小鼠精神狀態(tài)和活動情況,每周稱重一次,于實驗結(jié)束前一天禁食12h,次日稱重后經(jīng)小鼠眶后靜脈叢采集血液,離心取血清,使用全自動生化儀檢測各組小鼠血清生化指標(biāo):天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和甘油三酯(TG)。采集各組小鼠的肝臟稱重,計算其肝指數(shù)=肝臟重量(g)/小鼠體重(g)×100%,然后將所有采集的肝組織用10%的甲醛固定、脫水、包埋、切片和HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察分析各組小鼠肝臟的組織病理學(xué)結(jié)果。1.5處理數(shù)據(jù)各組的實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1對體重、肝指數(shù)的影響通過對三種近交系小鼠體重增長量和肝指數(shù)的對比分析:BALB/c模型組體重增長量和肝指數(shù)均明顯小于對照組(P<0.01,P<0.05);C57模型組體重增長量小于對照組(P<0.05),肝指數(shù)不具有統(tǒng)計學(xué)意義;C3H模型組體重增長量小于對照組(P<0.01),肝指數(shù)也不具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。2.2對alt、ast、tg的影響通過對三種近交系小鼠血清生化指標(biāo)的檢測分析:BALB/c模型組ALT、AST與對照組相比均顯著升高(P<0.01);C57模型組ALT、AST、TG與對照組相比均顯著升高(P<0.01);C3H模型組與對照組的ALT、AST、TG之間不具有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。2.3小鼠肝臟組織病理學(xué)檢測各對照組小鼠的肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞胞漿均勻,無脂肪空洞和炎性浸潤。BALB/c模型組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)大量散在的脂肪滴,脂肪變性明顯;而C57模型組小鼠肝細(xì)胞的胞質(zhì)中脂肪滴更多,明顯多于BALB/c小鼠,而且脂滴融合成空泡,空泡又融合成較大的囊泡結(jié)構(gòu),匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,BALB/c和C57模型組均還未出現(xiàn)肝纖維化病變;C3H組小鼠肝臟組織幾乎不存在脂肪空泡,脂肪變不明顯(彩插6圖1)。3酒精性肝損傷的細(xì)胞模型酒精性肝病是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病,最初表現(xiàn)為脂肪肝,進而可發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化。由于酒精性脂肪肝為可逆病變,因此研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機制和預(yù)防措施顯得尤為重要。國內(nèi)外研究者［7－9］為了闡明乙醇在體內(nèi)所導(dǎo)致肝臟損傷的發(fā)病機制,采用小鼠、大鼠、家兔和犬等動物來復(fù)制酒精性脂肪肝動物模型,但小鼠因其自身獨特的優(yōu)勢成為最佳的實驗動物,其中近交系BALB/c小鼠和C57小鼠最為常用。聶嬌等［10］利用C57小鼠對內(nèi)毒素在酒精性脂肪肝形成過程中的作用進行了相關(guān)研究;Sung等［11］也利用C57小鼠探索了IL-22由于具有抗氧化、抗凋亡、抗脂肪變的作用而對酒精性肝損傷具有改善作用。而廖彩佶等［12］則研究表明骨髓源性肝干細(xì)胞對BALB/c小鼠酒精性肝纖維化病變結(jié)構(gòu)和功能具有改善作用。但目前有關(guān)不同品種品系動物所建立的酒精性脂肪肝模型對于其研究結(jié)果是否存在差異還未見報道。因此,本實驗選取BALB/c、C57和C3H小鼠來建立酒精性脂肪肝模型,通過對三種近交系小鼠體重增長量和肝指數(shù)的對比分析,其模型組體重增長量均明顯小于對照組,說明長期酒精灌胃對小鼠的體重增長有影響,因此小鼠在造模過程中會出現(xiàn)身體逐漸瘦弱的現(xiàn)象,甚至出現(xiàn)BALB/c模型組3只動物死亡,C3H模型組1只死亡的現(xiàn)象,可能是由于小鼠對酒精的耐受力不同以及酒精的毒性造成的死亡。而C57模型組未見死亡,說明C57小鼠對酒精的耐受性相對較強。在酒精性脂肪肝造模過程中,自由基、酶及脂質(zhì)過氧化等在此過程中發(fā)揮著重要的作用,其中ALT和AST是肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一［13－14］。本實驗中BALB/c和C57模型組ALT、AST與對照組相比均顯著升高(P<0.01),符合轉(zhuǎn)氨酶升高的基本特點,另外,C57模型組的TG與對照組相比也存在明顯的升高現(xiàn)象(P<0.01),而C3H組的生化指標(biāo)無差異。在病理學(xué)檢測中C57模型組小鼠肝細(xì)胞脂肪滴明顯多于BALB/c和C3H組,而且脂滴已經(jīng)融合成囊泡結(jié)構(gòu),說明了C57模型組小鼠的脂肪病變最明顯,表明C57是復(fù)制酒精性脂肪肝模型最理想的實驗動物,這與Petrasek［15］、Tan［16］等選擇C57小鼠進行酒精性脂肪肝疾病研究的理念基本一致。綜上所述,利用三種不同品系的小鼠可建立酒精性脂肪肝動物模型,但