搞定慢病毒轉導常見問題解決以及實驗技巧分享你只要這么做

導讀：慢病毒滴度單位如何換算？如何擬定慢病毒MOI值？慢病毒感染效率低怎么破？細胞一添加慢病毒就死亡，是什么狀況？感染預實驗非做不可？好啦好啦，有關慢病毒轉導的這些那些問題我們將一一為您解答，助您輕松搞定慢病毒轉導實驗！一、如何添加最優(yōu)化的慢病毒量？擬定靶細胞MOI值不管是對活體還是體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞，慢病毒體現(xiàn)載體對遺傳物質的轉導效率至關重要。慢病毒最早來源于人免疫缺點病毒(HIV)或貓免疫缺點病毒（FIV），能夠感染幾乎全部類型的細胞，涉及難以用質粒轉染甚至無法用質粒轉染的細胞。許多客戶對如何用慢病毒顆粒進行轉導持有疑問，特別是對如何選擇適合的慢病毒量感到困惑。這個問題可根據(jù)擬定細胞的最佳感染復數(shù)（MultiplicityofInfectionMOI）來解決。滴度與MOI？TU/mL是現(xiàn)在使用最廣泛的慢病毒顆粒滴度單位，「TU」為「TransductionUnits」的縮寫，表達可成功轉導目的細胞的基因組數(shù)。選購慢病毒顆粒之前，首先需理解目的細胞的最佳感染復數(shù)：MOI。MOI的概念很簡樸，可有效感染細胞的慢病毒顆粒數(shù)與被感染細胞數(shù)的比值即為該細胞的MOI值。例如，應用106TU慢病毒感染106個細胞可成功使80%以上細胞達成轉導目的時，MOI=1；如需要以5×106TU病毒才可成功感染106個細胞，則MOI=5。（TU/mL為慢病毒滴度單位，TU表達有活性的慢病毒量）如何擬定目的細胞的MOI值?慢病毒對不同類型細胞的轉導效率各不相似，因此MOI也各異。在此，我們列出了多個慣用細胞系的MOI，助您選購適宜的慢病毒量。下表是GeneCopoeia通過實驗探索得出的多個細胞系的MOI參考值。理解慢病毒滴度是獲得最佳MOI的前提條件。根據(jù)上表，若您的實驗對象是乳腺癌細胞系MCF-7，其最佳MOI參考值=2，那么當您購置了50μL的慢病毒顆粒（滴度是108TU/mL）時，您得到的慢病毒總量為5×106TU。在MOI=2的條件下，您所購置的慢病毒足夠轉導MCF-7在24孔板中鋪板培養(yǎng)的其中5孔（約合4×105細胞/孔）。若您的目的細胞系MOI規(guī)定較高，您需要購置或自行包裝更多慢病毒顆粒。請注意：上表所示的MOI值僅供您選購慢病毒時作為用量參考。根據(jù)細胞狀態(tài)、操作手法等的差別，實際數(shù)據(jù)可能有輕微浮動。因此當您收到所購置的慢病毒時，我們仍然建議您通過設計梯度MOI感染小量細胞實驗（如：MOI=0.313510etc.）檢測目的細胞的轉導效率，確認其MOI值。另外，若您的實驗細胞未被列在上表中，梯度實驗擬定最佳MOI是至關重要，甚至必不可少的。您可將病毒進行梯度稀釋，分別感染等量的細胞（見圖1）。圖1.梯度稀釋慢病毒顆粒，探索細胞最佳MOI值進行轉導的1天前，于96孔板鋪板培養(yǎng)目的細胞(實例中使用了H1299細胞)；在進行轉導當天，以10倍梯度稀釋慢病毒并分別進行轉導；轉導72小時后以熒光顯微鏡觀察GFP報告基因體現(xiàn)狀況，擬定該細胞在最佳轉導效果下的慢病毒量。最后，若您的實驗細胞規(guī)定較高的MOI值您還可通過下列幾個辦法將其減少。辦法一是加入polybrene(hexadimethrinebromide)一種能夠減少病毒與細胞膜間電荷排斥作用的陽離子聚合物。另一種辦法是使用能夠捕獲慢病毒顆粒的磁珠（例如，運用磁珠可成功地將MM-AN細胞的MOI從16降到4）。購置或構建克隆時，可選擇載體骨架上帶有標記基因（如：PuromycinNeomycin等）的克隆，可方便后續(xù)進行藥品篩選，建立將目的基因成功地隨機整合到特定細胞的穩(wěn)定細胞株。二、慢病毒感染目的細胞實驗環(huán)節(jié)1.感染預實驗以24孔培養(yǎng)板為例，同時進行目的細胞和工具細胞的感染預實驗。工具細胞可選擇293T（人胚腎上皮細胞）、H1299（人肺癌細胞）或其它細胞。實驗材料：培養(yǎng)基、24孔培養(yǎng)板，移液槍，槍頭，EP管，細胞計數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細胞狀況，可酌情使用Polybrene）Day1：準備細胞：培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長久，細胞以胰酶消化計數(shù)后，用細胞計數(shù)測出細胞密度，每孔接種5×104個細胞，添加細胞培養(yǎng)液至500μL。普通狀況下，該接種量的H1299或293T細胞在感染后第3天可生長至80%-90%融合度。（接種目的細胞時，請根據(jù)細胞的實際生長速度調節(jié)接種量，使目的細胞感染后第3天生長至80%-90%融合度）Day2：（1）準備慢病毒顆粒：計算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在-80℃的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；（2）感染目的細胞：從培養(yǎng)箱中拿出細胞，置于顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及細胞融合度；如細胞狀態(tài)較好，則開始實驗：A.用移液槍小心吸去24孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液；B.在細胞中分別加入計算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺上，以劃8字的方式輕柔混勻；C.混勻后，細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。Day3：更換培養(yǎng)液：感染12-16小時后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含5%滅活FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細胞需要調節(jié)感染時長，部分細胞不可感染超出12小時。）Day4：繼續(xù)培養(yǎng)細胞，觀察細胞狀態(tài)與否有異常。Day5：觀察（評定）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊24孔培養(yǎng)板，使用70%乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并預計慢病毒顆粒對細胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因體現(xiàn)所需的時間較長，熒光體現(xiàn)所需時間也較長，建議感染72、96小時后觀察熒光體現(xiàn)。）根據(jù)熒光狀況，能夠初步從MOI梯度探索實驗中，找出最適合目的細胞的MOI值。圖1.H1299細胞的MOI梯度探索成果示例示例中使用的慢病毒顆粒是LPP-eGFP-Lv105（滴度1×108TU/mL），曝光時間1s，顯微倍數(shù)100×。從上圖可見第2組細胞的感染效率已達成90%。由于慢病毒顆粒對細胞有一定毒性，當MOI值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。熒光報告基因和目的基因的相對體現(xiàn)并不總是成等比關系的。在有的狀況下，即使熒光報告基因體現(xiàn)較低或無體現(xiàn)，目的基因仍然能夠體現(xiàn)；反之亦然。因此在觀察熒光效果后，建議使用qRT-PCR作進一步鑒定。圖2.293T細胞的MOI梯度探索成果示例示例中使用的慢病毒顆粒是LPP-eGFP-Lv105（滴度1×108TU/mL），曝光時間0.6s，顯微倍數(shù)100×。從上圖可見第2組細胞的感染效率已達成80%。由于慢病毒顆粒對細胞有一定毒性，當MOI值過高時，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。2.探索細胞的最適藥品篩選濃度細胞的種類與狀態(tài)均會影響慢病毒顆粒轉導效率，部分細胞可能與慢病毒顆粒有互相抵抗的現(xiàn)象，造成感染效率低。當您在感染后72、96小時后發(fā)現(xiàn)感染效果仍不抱負，建議對感染后的細胞進行藥品篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細胞。慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細胞基因組是隨機發(fā)生的非同源性重組，當抗性基因體現(xiàn)時，目的基因不一定也能體現(xiàn)，在進行藥篩解決后，還要以qRT-PCR作進一步鑒定。在進行正式的抗生素篩選前，建議您先對空白細胞的最小致死濃度進行探索、優(yōu)化。表4.抗生素篩選細胞的有關參考值以293T細胞+Puromycin為例，從有關文獻查得Puromycin對293T細胞的最小致死濃度為2μg/mL。在2μg/mL附件多設立幾個濃度梯度，能夠得出較精確的的篩選濃度。（1）準備24孔培養(yǎng)板，按每孔1-5×104細胞數(shù)(約等于20%-35%融合度)接種293T空白細胞，對其中6個孔進行鋪板；（2）普通Puromycin母液的濃度是10mg/mL，用細胞培養(yǎng)基將Puromycin母液稀釋1000倍，可獲得終濃度為10μg/mL的Puromycin稀釋液；（3）按表5所示，每孔添加對應的細胞培養(yǎng)基和Puromycin；（4）24孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；（5）按表4的藥篩時間和觀察時間建議，定時在熒光顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。當空白細胞剛好能全部死亡時，該濃度的抗生素可作為最適藥篩濃度。表5.藥品篩選濃度梯度參考（Puromycin）*表格中使用的Puromycin濃度為10μg/mL，是由10mg/mL的Puromycin母液以細胞培養(yǎng)液稀釋1000倍所得。注：以上表格的設立僅供參考。普通即使細胞同樣，由于培養(yǎng)的條件和傳代次數(shù)不同，篩選濃度亦不同。可根據(jù)實驗成果進行更進一步的細化濃度梯度設立。如果藥篩過程中細胞量較少，為保持細胞的數(shù)一定，普通不換液，只有在穩(wěn)轉株藥篩過程中，根據(jù)細胞生長速度，3-4天換液一次。如果目的細胞較難感染，一次感染不能達成預期效果時，在感染3天后可對目的細胞進行藥篩解決，獲得較多被感染的細胞，以下列例子所示：圖3.人食管癌細胞CE-81T（貼壁細胞）的藥篩前后效果對比圖4.人骨肉瘤細胞Hos（貼壁細胞）的藥篩前后效果對比圖5.人白血病K562（懸浮細胞）的藥篩前后效果對比附：細胞融合度參考圖6.293T細胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數(shù)：100×）3.實驗體系的放大和正式實驗；根據(jù)預實驗成果，放大慢病毒顆粒細胞感染實驗，實施正式實驗。通過慢病毒顆粒感染細胞的預實驗，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細胞的優(yōu)化條件。正式實驗所用的細胞數(shù)往往比預實驗多，慢病毒顆粒用量也需要適宜放大。放大原則是保持細胞密度一致，按實際細胞數(shù)與預實驗細胞數(shù)的比例放大培養(yǎng)液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大辦法可供參考：按底面積放大（合用于貼壁細胞）當細胞的密度不變時，細胞總數(shù)和底面積成正比，且MOI不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設預實驗使用96孔板（底面積0.3cm2），使用1μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）可成功感染細胞；如正式實驗使用6孔板（底面積10cm2），則：底面積的放大倍數(shù)≈33正式的慢病毒顆粒用量=預實驗用量×33=33μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）注：請確保細胞均勻、單層分布，不成簇生長。按培養(yǎng)體積放大（合用于懸浮細胞）當細胞的密度不變時，細胞總數(shù)和感染體積成正比，且MOI不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養(yǎng)液體積成正比。假設預實驗使用96孔板（培養(yǎng)體積100μL），使用1μL慢病毒（滴度1×108TU/mL）可成功感染細胞；如正式實驗使用6孔板（培養(yǎng)體積2mL），則：培養(yǎng)體積的放大倍數(shù)=20正式的慢病毒顆粒用量=預實驗用量×20=20μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）注：請確保細胞生長狀態(tài)良好。三、使用慢病毒的常見問題1.如何購置份量適宜數(shù)量的慢病毒顆粒？一套完整實驗所需的慢病毒顆粒涉及：1.含有目的基因的慢病毒顆粒，2.陰性對照慢病毒顆粒，3.用于預實驗的陽性對照慢病毒顆粒。購置時能夠根據(jù)目的細胞特性、檢測辦法、培養(yǎng)器皿估算慢病毒顆粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒顆粒超出最佳保存期；另外，GeneCopoeiaTM同時提供高滴度低價格的陽性對照慢病毒顆粒，協(xié)助您以較低的預算和較充足的材料完畢預實驗的條件探索。初次使用慢病毒顆粒的研究者也可使用陽性對照慢病毒顆粒熟悉實驗過程。2.慢病毒顆粒能夠用于動物體內（Invivo）實驗嗎？GeneCopoeiaTM提供的即用型慢病毒顆粒全部通過純化、濃縮解決，去除了細胞碎片等雜質，進一步減少免疫原性，合用于各類活體動物注射實驗和成瘤實驗。3.慢病毒顆粒對目的細胞的感染效率很低，如何提高感染效率？提高感染效率的前提是確保細胞生長狀態(tài)良好。另首先，能夠通過提高MOI值來提高感染效率，也能夠在培養(yǎng)基中加入Polybrene(4-10μg/mL)提高感染效率。4.添加慢病毒顆粒后，細胞為什么大量死亡?慢病毒顆粒對靶細胞有一定毒性。添加量過多、感染時間過長都可能對目的細胞造成傷害。如遇上這種狀況，建議您減少MOI值，并在感染細胞4-8小時后進行換液（以新鮮的全培養(yǎng)基替代含慢病毒顆粒的舊培養(yǎng)基），最長換液時間不可不不大于12小時。5.Polybrene是什么？在慢病毒顆粒感染中，Polybrene添加越多越好嗎？Polybrene是慣用的感染添加劑，普通的使用濃度為4-10μg/mL，Polybrene能明顯提高慢病毒的感染效率，普通能提高感染效率2-10倍，對部分細胞甚至可提高感染效率10-20倍。當目的細胞MOI高于20時，我們建議在培養(yǎng)基中加入Ploybrene(約4-10μg/mL)適宜提高感染效率。然而，Polybrene有一定的細胞毒性，不同細胞對Polybrene的敏感度和耐受性不同，部分細胞對Polybrene反映明顯，容易造成細胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡，因此并非每種細胞都適合添加Polybrene。在正