蛋白質(zhì)分子的定向進(jìn)化

蛋白質(zhì)的定向進(jìn)化基本概念同源建模能量最小化定向進(jìn)化易錯PCR誘導(dǎo)突變噬菌體展示抗體工程同源建模不同來源或者不同生物功能的蛋白質(zhì)可能有相似的結(jié)構(gòu)，通常認(rèn)為序列相似意味著結(jié)構(gòu)相似。因此，同源建模法就是利用結(jié)構(gòu)已知的家族成員（模板）預(yù)測新序列的結(jié)構(gòu)。同源建模法一般包含以下幾個步驟：第一，識別模擬的模板；第二，目標(biāo)序列和模板序列的排列；第三，構(gòu)建模型；第四，構(gòu)建非保守的loop區(qū)；第五，安裝側(cè)鏈；第六，模型修飾；第七，結(jié)構(gòu)合理性評估熵1864年法國物理學(xué)家克牢修斯提出了一個物理量和新函數(shù)——熵，熵是熱力學(xué)系統(tǒng)的態(tài)函數(shù)，在絕熱系統(tǒng)中熵變永遠(yuǎn)不會為負(fù)。各生命體的生命活動過程是具有耗散結(jié)構(gòu)特征的、開放的非平衡系統(tǒng),生命現(xiàn)象也與熵有著密切關(guān)系,生命體和一切無機(jī)物的一個根本區(qū)別是它具有高度有序性。一個無序的世界是不可能產(chǎn)生生命的，有生命的世界必然是有序的。生物進(jìn)化是由單細(xì)胞向多細(xì)胞、從簡單到復(fù)雜、從低級向高級進(jìn)化，也就是說向著更為有序、更為精確的方向進(jìn)化，這是一個熵減的方向，與孤立系統(tǒng)向熵增大的方向恰好相反，可以說生物進(jìn)化是熵變?yōu)樨?fù)的過程，即負(fù)熵是在生命過程中產(chǎn)生的。自由能氨基酸序列與蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系研究源于美國生物化學(xué)家安芬森（C.Anfinsen）。1961年，他研究了核糖核酸酶的去折疊和重折疊過程，發(fā)現(xiàn)在相同的環(huán)境中去折疊的蛋白質(zhì)都會恢復(fù)到原來的空間結(jié)構(gòu)，認(rèn)為蛋白質(zhì)鏈會以自由能最低的方式形成三維結(jié)構(gòu)，由此推測蛋白質(zhì)的折疊密碼隱藏在氨基酸排序中，即所謂的安芬森原則：蛋白質(zhì)一級排序決定三維結(jié)構(gòu)。因?yàn)椤皩刂频鞍踪|(zhì)鏈折疊原理的研究”，安芬森獲得1972年諾貝爾化學(xué)獎。

定向進(jìn)化基本概念：屬于蛋白質(zhì)的非理性設(shè)計(jì)，它不需要事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨即突變、基因重組、自然選擇），在體外改造酶基因，并定向選擇（或篩選）出所需性質(zhì)的突變酶。原理：在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’一5‘校對功能的性質(zhì)，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。分子定向進(jìn)化其實(shí)是突變加篩選／選擇的重復(fù)循環(huán)，且整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的。定向進(jìn)化與定向突變定向進(jìn)化（隨機(jī)突變+定向選擇=目標(biāo)突變體）突變位點(diǎn)隨機(jī)，不確定突變數(shù)目不確定突變效應(yīng)不可預(yù)知凡是能夠引起突變的因素都可以應(yīng)用于定向進(jìn)化中突變體的產(chǎn)生定向突變突變位點(diǎn)確定突變數(shù)目確定、可預(yù)知突變效應(yīng)可能是已知的也可能是未知的定點(diǎn)突變的方法一般是以PCR為基礎(chǔ)的易錯PCR采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，例如提高鎂離子濃度，加入錳離子．改變體系中四種dNTP的濃度等，使用低保真度的Taq酶，從而向目的基因中．以一定的頻率隨機(jī)引入突變構(gòu)建突變庫，然后選擇或篩選需要的突變體。DNA改組從正突變基因庫中分離得到的同源DNA用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA堿基序列重新排布，從而引起基因突變的技術(shù)過程交錯延伸PCR交錯延伸(staggerextensionprocess,StEP)PCR是在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反應(yīng)時間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。此過程反復(fù)進(jìn)行，直到產(chǎn)生完整的基因長度。突變基因的篩選方法利用底物顯色反應(yīng)改變培養(yǎng)條件(如逐步提高培養(yǎng)溫度,或改變培養(yǎng)基的pH等)利用某些蛋白的固有性質(zhì),如產(chǎn)生綠色熒光高通量篩選(HTS:HighThroughoutScreening),該技術(shù)可以根據(jù)待測樣品的合成路線分為液相和固相篩選,也可以根據(jù)篩選目標(biāo)物分為純蛋白受體親合性篩選,酶活性篩選,細(xì)胞活性篩選等。細(xì)菌誘發(fā)突變的因素500C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！高通量篩選方法噬菌體表面展示技術(shù)細(xì)菌表面展示技術(shù)酵母表面展示技術(shù)核糖體展示技術(shù)酵母雙雜交系統(tǒng)蛋白質(zhì)片斷互補(bǔ)試驗(yàn).噬菌體展示技術(shù)(PhageDisplay)

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外