預(yù)處理技術(shù)-蛋白質(zhì)的沉淀（藥物分離純化技術(shù)課件）

變性沉淀變性沉淀當?shù)鞍踪|(zhì)受到外界因素作用時，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則排列，其物理性質(zhì)也發(fā)生改變，并失去原有的生理活性，即蛋白質(zhì)發(fā)生變性，變性蛋白質(zhì)在水中的溶解度較小而以沉淀的形式從溶液中析出。利用蛋白質(zhì)的變性作用，除去混合液中雜蛋白的方法，稱為變性沉淀法。變性沉淀變性沉淀方法加熱：利用蛋白質(zhì)等生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱破壞某些組分，而保存另一些組分。加入化學試劑：金屬鹽、表面活性劑、某些有機酸、酚、鹵代烷等可使混合液中的蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而沉淀。調(diào)節(jié)pH值：當溶液的酸堿性發(fā)生劇烈變化時，可引起蛋白質(zhì)的變性而沉淀。變性沉淀特點使蛋白質(zhì)溶解度變小，變性沉淀加熱法只適用于對熱穩(wěn)定的生化物質(zhì)加熱使液體黏度降低，加快過濾速度變性沉淀是否可逆？常用的方法有哪些？思考題等電點沉淀為什么要進行預(yù)處理？發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對后續(xù)分離影響最大的是高價無機離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。發(fā)酵液中細微顆粒包括懸浮物和膠體顆粒，沉降困難。預(yù)處理的條件預(yù)處理初步純化目的產(chǎn)物在胞外細胞破碎目的產(chǎn)物在胞內(nèi)固液分離發(fā)酵液預(yù)處理的目的⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離的效率。⑵盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多數(shù)是液相)。⑶去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。預(yù)處理方法的選擇藥物自身理化性質(zhì)藥物穩(wěn)定性藥物分子量藥物的活性預(yù)處理的方法沉淀凝聚和絮凝一、沉淀常用的幾種方法等電點法變性沉淀法鹽析有機溶劑沉淀法反應(yīng)沉淀法（去除蛋白質(zhì)和無機金屬離子）去除蛋白質(zhì)導致膠體穩(wěn)定性的原因方法選擇的目的破壞雙電層結(jié)構(gòu)破壞水化膜因合并而沉降1.等電點沉淀法等電點（PI）：蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電荷，堿性溶液中帶負電荷，而在某一PH值下，凈電荷為零，稱為等電點。此時在水中溶解度最小，能沉淀除去。一般羧基電離度大于氨基，所以很多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0~5.5）pH值對蛋白質(zhì)荷電情況的影響

蛋白質(zhì)的滴定曲線

不同的蛋白質(zhì)由于其氨基酸組成的差異，具有不同的等電點（pI），當溶液（環(huán)境）pH值低于其pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，而當環(huán)境pH值高于其等電點時，蛋白質(zhì)帶負電荷，且偏離等電點越多，其所帶電荷越多.沉淀方法：加酸常用酸化劑：硫酸、鹽酸、磷酸、草酸等1.等電點沉淀法等電點沉淀法的特點不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點不同避免直接用強酸強堿調(diào)節(jié)PH，引起目的藥物成分蛋白或酶的變性各種蛋白質(zhì)在等電點時，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，可以考慮采用幾種方法結(jié)合來實現(xiàn)沉淀分離。反應(yīng)沉淀5.反應(yīng)沉淀法定義：在反應(yīng)液中加入某些不影響目的藥物的化學反應(yīng)試劑，使其與雜質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成不溶性沉淀的方法。常用的反應(yīng)沉淀試劑金屬鹽類有機酸類表面活性劑離子型或非離子型的多聚物變性劑機理：加入的化學試劑與蛋白質(zhì)結(jié)合形成難溶性的復合物沉淀。應(yīng)用：除去雜蛋白；除去對提取和成品質(zhì)量影響較大的無機離子雜質(zhì)，

主要是Ca2+、Mg2+、Fe3+等高價金屬離子5.反應(yīng)沉淀法鹽析沉淀3．鹽析沉淀法當中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降鹽析機理中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導致沉淀。鹽離子與蛋白質(zhì)表面具有相反電性的離子基團結(jié)合，形成離子對，即鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的電排斥作用減弱而相互靠攏、聚集形成沉淀。常用的鹽析劑硫酸銨：溶解度大（767g/L）硫酸鈉磷酸鹽檸檬酸鹽鹽析的影響因素鹽析劑的性質(zhì)和加入量

（1）符合鹽析分布曲線（2）一般陰離子的鹽析效果比陽離子好。對于陰離子，帶電荷較多者，鹽析能力較強，對于陽離子，帶電荷較多者，鹽析能力較低。鹽析的影響因素蛋白質(zhì)類化合物溶液的濃度：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降。鹽析的影響因素pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近。蛋白質(zhì)類化合物的性質(zhì)：各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，鹽析沉淀的鹽濃度、pH、溫度等操作條件不同。有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致沉淀。由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。利用與水互溶的有機溶劑（如甲醇、乙醇、丙酮等）能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法，稱為有機溶劑沉淀。常用的有機溶劑沉淀劑乙醇：沉淀作用強，揮發(fā)性適中，無毒。常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉淀作用更強，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣。

有機溶劑沉淀的特點分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應(yīng)注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇介電常數(shù)要小致變性作用要?。状迹┒拘砸　]發(fā)性適中水溶性要好影響有機溶劑沉淀的主要因素溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。離子強度：