瓜子金皂苷己對mpp

瓜子金皂苷己對mpp

帕金森病（parkinsonue679sdiseases，pd）是一種常見的慢性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜振動、肌肉僵硬和運動遲緩。病變的病理變化主要是嚴重的黑質(zhì)環(huán)境區(qū)（sn）。多媒體神經(jīng)退行性死亡和缺失。目前該病的發(fā)病機制尚不明確,但有研究表明,在PD中選擇性多巴胺能神經(jīng)元損傷與細胞凋亡密切相關(guān)。MPP+(1-methyl-4-pheny1-pyridinium)是一種多巴胺能神經(jīng)元毒性劑,被廣泛應(yīng)用于PD發(fā)病機制和藥效學(xué)評價的研究。瓜子金(PolygalajaponicaHoutt.)別名金鑰匙,小遠志等,為遠志科遠志屬植物,具有祛痰止咳,寧心安神等功效。瓜子金皂苷己(polygalasaponinF,PS-F)是瓜子金提取物,為齊墩果烷型三萜皂苷。體外研究發(fā)現(xiàn),瓜子金皂苷己對MPP+導(dǎo)致PC12細胞的損傷具有保護作用,本研究初步探討瓜子金皂苷己對MPP+損傷PC12細胞保護作用的機制,為其應(yīng)用于PD的臨床治療提供理論依據(jù)。1材料表面1.1從中國科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心購買pc12細胞菌，該細胞將被傳喚并保存1.2mtt--actin抗體和培養(yǎng)基DMEM及馬血清(Gibco公司);胎牛血清(Hyclone公司);MPP+、噻唑藍[3-(4,5-dimethyhhyhhiazol-2-y1)-2,5-diphenyhetrazoliumbromide,MTT]、β-actin抗體(Sigma公司);AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司),JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑(北京普利萊基因技術(shù)有限公司);Caspase-3抗體(CellSignalingTechnology);HRP標記的羊抗兔IgG抗體(SantaCruz);其他試劑為國產(chǎn)或進口分析純試劑。1.3顯微鏡選擇1.2ECL檢測系統(tǒng)型號:柯達EDAS-120;酶標儀型號:ThermoSKANITSOFTWARE3.2;倒置顯微鏡型號:Olympus,IX70-142;流式細胞分析儀:BDFACSCalibur。2方法2.1pc12細胞培養(yǎng)和分離PC12細胞置于含5%胎牛血清、5%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng),每隔48h換培養(yǎng)液,當(dāng)單層培養(yǎng)細胞匯合80%以后,傳代培養(yǎng)。實驗時將PC12細胞傳入培養(yǎng)板中,待細胞進入對數(shù)生長期進行試驗。實驗分為空白對照組、MPP+處理組、MPP++瓜子金皂苷己(0.10、1.00、10.00μmol·L-1)處理組,共5組。2.2mtt法對細胞的存活率進行檢測2.2.1mtt法檢測細胞存活率PC12細胞按5×107·L-1濃度接種于96孔板中,每孔100μl(5000個細胞/孔),培養(yǎng)24h,加入含有濃度為100、250、500、750、1000μmol·L-1MPP+的培養(yǎng)基處理,每組設(shè)6個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48h,MTT法檢測細胞存活率。2.2.2ps-f對破壞細胞存活率的影響細胞接種于96孔板,24h后,按組別分別給予相應(yīng)處理,每組設(shè)6個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48h,MTT法檢測細胞存活率。2.2.3dmso-ldmso法每孔加入10μlMTT,37℃、5%CO2的孵育箱中孵育4h,棄培養(yǎng)基,每孔加入100μlDMSO,震蕩至晶體顆粒溶解,10min后在酶標儀上測定570nm處的吸光度(A)值。細胞存活率/%=(實驗組平均A值/對照組平均A值)×100%。2.3pi和/pv-同型半胱氨酸鈉pi的檢測用0.25%的胰酶消化細胞,懸浮于無血清DMEM中,4℃、1500r·min-1離心5min,預(yù)冷的PBS洗1次,細胞重懸于200μlBindingBuffer,加入10μlAnnexinV-FITC室溫避光反應(yīng)15min,加入5μlPI和300μlBindingBuffer,室溫反應(yīng)5min后上機檢測。2.4熒光顯微鏡觀察37℃無血清的DMEM洗滌細胞1次,每孔加入1.5ml的JC-1(5mg·L-1),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育20min,DMEM洗2次,倒置熒光顯微鏡下觀察。2.5重組人細胞nfm和b.n-l-1-2和蛋白酶抑制劑ris收集細胞,預(yù)冷PBS洗兩遍,加入細胞裂解液(1%NonidetP-40,150mmol·L-1NaCl,50mmol·L-1Tris,pH7.4,1mmol·L-1EDTA和蛋白酶抑制劑),置于冰上裂解30min后,4℃,12000r·min-1離心30min。取上清,BCA試劑盒蛋白定量,細胞總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。20μg蛋白經(jīng)10%SDS膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜,3%BSA室溫封閉2h,加入一抗4℃過夜,TBS-Tween洗膜后加HRP標記的二抗,室溫孵育2h,加入ECL發(fā)光液,進行檢測。2.6統(tǒng)計分析3結(jié)果3.1mpp+濃度對小鼠細胞存活率的影響MTT檢測結(jié)果(Fig1)顯示,正常PC12細胞給予不同濃度MPP+48h后,細胞存活率隨藥物濃度的增加而劑量依賴性降低。當(dāng)MPP+濃度在500μmol·L-1時,細胞存活率基本維持在60%左右。為使細胞處于損傷狀態(tài)又不致使細胞過度死亡,選擇500μmol·L-1作為后續(xù)實驗濃度。3.2瓜子金皂苷對小鼠細胞存活率的影響MTT結(jié)果(Fig2)顯示,500μmol·L-1MPP+導(dǎo)致PC12細胞存活率下降,同時給予不同濃度瓜子金皂苷己可增加細胞存活率,在0.10、1.00、10.00μmol·L-1范圍內(nèi)具有濃度依賴性,其中1.00和10.00μmol·L-1濃度組與MPP+處理組比較差異有顯著性。3.3ps-f對不同比例小鼠細胞凋亡的影響采用AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的變化,研究瓜子金皂苷己對MPP+誘導(dǎo)PC12細胞凋亡的影響。結(jié)果(Fig3)顯示的是細胞凋亡分析的二維散點圖,其中左下象限顯示活細胞,為FITC-1/PI-1;右下象限是早期凋亡細胞,為FITC+1/PI-1;右上象限是晚期凋亡或壞死細胞,為FITC+1/PI+1;左上象限為死亡細胞,為FITC-1/PI+1。由圖可見,在檢測過程中正常PC12細胞有少量的損傷凋亡。經(jīng)MPP+處理后早期凋亡是其受損的主要形式,細胞凋亡率由空白組的2.68%增加到54.81%。在造模同時加入PS-F能減少細胞早期凋亡率,0.10、1.00、10.00μmol·L-1濃度組早期凋亡率分別為39.04%、33.43%、29.73%,呈劑量依賴性降低,從而使活細胞比例增加。表明實驗濃度的PS-F能在一定程度上抑制MPP+誘導(dǎo)細胞發(fā)生早期凋亡,保護PC12細胞免受損傷。3.4細胞線蟲膜電位結(jié)果(Fig4)顯示,正常PC12細胞呈均勻的強紅色熒光,表示線粒體膜電位正常,僅有(5.51±1.84)%的細胞線粒體膜電位降低;經(jīng)MPP+處理后,紅色熒光強度減弱,綠色熒光增強,線粒體受損,有(76.71±4.31)%細胞線粒體膜電位降低;造模同時加入0.10、1.00、10.00μmol·L-1濃度的PS-F,紅色熒光逐漸增強,綠色熒光減弱,能夠抑制線粒體膜電位降低,分別為(55.19±2.84)%、(36.75±1.47)%、(23.61±2.23)%,表明實驗濃度的PS-F能濃度依賴性的抑制MPP+損傷線粒體膜電位的降低,維持線粒體穩(wěn)定。3.5mpp+損傷caspase-3的表達Caspase-3是細胞凋亡發(fā)生的重要執(zhí)行蛋白之一,在正常細胞主要以其前體procaspase-3的形式存在無酶活性,細胞發(fā)生凋亡后形成有活性的Caspase-3,其分子量為17ku。Westernblot結(jié)果(Fig5)顯示,在正常細胞中沒有活性Caspase-3的表達,經(jīng)MPP+損傷后Caspase-3的表達明顯升高,而不同濃度PS-F組能濃度依賴性的降低活化Caspase-3的表達。結(jié)果表明PS-F對抗MPP+誘導(dǎo)的凋亡與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。4ps-f對caspase-3誘導(dǎo)pc12細胞凋亡的影響PD是一種由多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失引發(fā)的運動功能障礙性疾病。其發(fā)病機制尚未明確,越來越多的研究表明選擇性多巴胺能神經(jīng)元損傷及神經(jīng)元凋亡與PD的發(fā)生密切相關(guān)。凋亡是細胞程序性死亡的一種形式,在凋亡過程中,細胞體積縮小,細胞質(zhì)密度增加,線粒體功能改變,核破碎等。線粒體作為細胞能量合成、貯存、轉(zhuǎn)化及物質(zhì)代謝的重要場所,在細胞凋亡過程中會產(chǎn)生一系列的變化:線粒體膜通透性增加,跨膜電位消失,釋放Caspase激活因子(如細胞色素C)等,在細胞凋亡進程中起樞紐作用。Caspase是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)中的半胱氨酸蛋白水解酶,能夠特異的水解天冬氨酸殘基后的肽鍵,導(dǎo)致細胞凋亡。在細胞中,Caspase均以無活性的酶原狀態(tài)存在,可由線粒體釋放的細胞色素C介導(dǎo)激活。Caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的啟動細胞死亡程序。PC12細胞為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞克隆的細胞株,它能表達酪氨酸羥化酶并合成多巴胺,因此也常用來作為研究多巴胺能神經(jīng)元的有利工具。MPP+是MPTP在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物,能夠選擇性的抑制線粒體傳遞鏈復(fù)合物I,改變線粒體外膜通透性,導(dǎo)致細胞質(zhì)內(nèi)細胞色素C的含量增加,促進凋亡蛋白(包括Caspase-3)的表達。線粒體膜電位(MMP)下降是早期細胞凋亡過程中不可逆的變化。JC-1是一種特異性陽性染料,在MMP較高時,以聚合物形式聚集在線粒體的基質(zhì)中;MMP較低時,JC-1以單體形式存在于線粒體的胞質(zhì)中。在490nm波長下可以激發(fā)單體產(chǎn)生綠色熒光,聚集體產(chǎn)生紅色熒光,據(jù)此可判斷MMP的變化。熒光顯微鏡觀察MPP+處理后細胞MMP明顯下降,而PS-F可明顯提高MMP。此結(jié)果與AnnexinV/PI雙染流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果一致。Caspase-3作為細胞發(fā)生凋亡的重要執(zhí)行蛋白之一,是PD患者與動物模型腦中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元凋亡的易感因子和最終效