低鈣聯(lián)合高蛋白飼料對大鼠松質(zhì)骨與代謝的影響

低鈣聯(lián)合高蛋白飼料對大鼠松質(zhì)骨與代謝的影響

核電站骨質(zhì)疏松癥是一種全身骨病，特征是骨量少、骨組織顯微結(jié)構(gòu)退化，導致骨脆弱性增加，骨折風險增加。營養(yǎng)和礦物鹽對骨量的維持起重要作用,特別是其中的蛋白質(zhì)及鈣質(zhì)。本研究通過檢測骨生化指標、骨計量學和掃描電鏡對低鈣聯(lián)合高動物蛋白作用于大鼠松質(zhì)骨及代謝的影響進行初步探討。骨小梁的檢測動物與飼料清潔級健康雌性SD大鼠及飼料,由本校實驗動物科學部提供。動物分組和實驗方法3周齡SD大鼠20只,隨機均分為2組,每組10只。實驗組大鼠攝食為滅菌的低鈣高蛋白飼料(Ca0.025%,protein27%),對照組為滅菌的標準飼料(Ca1%,protein18%)。連續(xù)喂養(yǎng)6月后處死。實驗指標觀測骨代謝生化指標每組實驗結(jié)束時,在處死前24h代謝籠分別收取24h尿液,次日以采用5%氯胺酮腹腔麻醉后,摘眼球采血法留取血標本,離心取血清,-20℃冰箱保存待測,酶標法測定血清中的骨鈣素(BGP)、骨源性堿性磷酸酶(BALP),尿樣尿脫氧吡啶酚/肌酐(DPD/Cr),尿吡啶酚/肌酐(PYD/Cr)。單克隆抗體酶免疫試劑藥盒由MetraBiosystems,Inc提供。骨形態(tài)計量學研究大鼠處死后立即取出L3椎體,去除附件及附著的軟組織,放入丙酮溶液中固定24h。乙醇逐級脫水,每次24h,最后二甲苯透明4h,甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycut-s型硬組織切片機上切片,沿椎體中部冠狀面切厚度為4μm的切片。甲苯胺藍染色,參照Parfitt等骨小梁參數(shù)計量方法,借助Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)進行測量。參數(shù)包括骨小梁面積百分數(shù)(Tb.Ar%),骨小梁厚度(Tb.Wi),骨小梁間距(Tb.Sp),小梁連結(jié)點數(shù)(N.Nd)和游離末端數(shù)(N.Tm)之比(NTR)。腰椎椎體顯微結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察每組大鼠隨機取L4椎體,沿矢狀面縱向切開,注射器吸生理鹽水沖洗剖面后,用2.5%的戊二醛溶液固定24h以上;后反復用0.1mmol/LPBS浮洗,10%次氯酸鈉溶液處理6h,蒸餾水反復浮洗,50%、70%、90%、100%丙酮逐級脫水,50%、70%、90%、100%醋酸正戊酯逐級置換,臨界點干燥儀干燥,離子濺射儀真空噴鍍金膜,用JSM5600LV掃描電鏡觀察攝片(放大倍數(shù)為100和200倍)。統(tǒng)計學處理采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計運算,運用levenetest檢驗兩樣本方差齊性,根據(jù)方差齊性與否,分別采用t檢驗和校正t檢驗對結(jié)果進行顯著性分析,所有參數(shù)均以xˉ±sxˉ±s表示。.05各升為基骨代謝生化指標從表1中可看出,實驗組骨源性堿性磷酸酶與對照組無顯著差異(P>0.05),骨鈣素(P<0.01)、尿吡啶酚/肌酐(P<0.01)和尿脫氧吡啶酚/肌酐(P<0.05)升高最為明顯。骨計量學參數(shù)從表2中可看出,實驗組中骨小梁面積減少,骨小梁厚度出現(xiàn)顯著變窄(P<0.01),、骨小梁結(jié)點末端比下降(P<0.05),骨小梁間距增寬但無統(tǒng)計學意義。掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)實驗組掃描電鏡下形態(tài)學顯示,骨小梁數(shù)目明顯減少,纖細、稀疏,排列紊亂;有的骨小梁有吸收穿孔,斷裂,骨髓腔擴大;小梁間距離增大,吸收孔大小不一、形狀各異;一些骨小梁形成盲端游離于骨髓腔中,其立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)受到破壞,骨的應力結(jié)構(gòu)變差(圖1A、B)。對照組骨小梁數(shù)目較多,骨小梁厚度較為均勻,形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1C)。蛋白質(zhì)飲食營養(yǎng)方面的骨代謝及流行病發(fā)生的影響骨質(zhì)疏松的飲食危險因素包括鈣攝入減少,維生素D不足,膳食中的鈉、蛋白質(zhì)、有機磷含量過高等。當鈣攝入不足或鈣吸收功能低下使機體缺鈣時,可繼發(fā)引起甲狀旁腺激素(PTH)分泌增多,使骨吸收亢進。長期缺鈣將導致骨量丟失,發(fā)生骨質(zhì)疏松癥。另外,有報道骨量與遺傳、機械負荷、骨峰量值和營養(yǎng)內(nèi)分泌狀況等有關(guān)。從胎兒時期保持充足的鈣攝入量,可以提高骨峰量值。骨峰量值增高,骨儲備多,對中老年的骨量丟失緩沖能力強,使骨量減少保持在閾值以上,從而延緩或減輕骨質(zhì)疏松的發(fā)生。大鼠在幼時鈣攝入不足,其骨峰量值下降,而低骨峰量值使增齡后骨質(zhì)疏松發(fā)生的風險大大增加。其次,有流行病調(diào)查報道,人群中蛋白質(zhì)攝入量與骨密度顯著負相關(guān)。高蛋白攝入使尿中代謝固定酸含量增加,腎近曲小管鈣重吸收減少,尿鈣增加,同時激發(fā)胰島素與胰島素生長因子對骨細胞調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)攝入大多與磷結(jié)合,同時增加磷的吸收。后者能減少尿鈣排泄,抵消高蛋白攝入引起的尿鈣增加,但磷使鈣從糞便中排泄量上升,所以過多的蛋白攝入的凈效應是增加負鈣平衡。本研究實驗組飼料中蛋白質(zhì)含量高并且鈣質(zhì)不足,二者同時作用于機體時,實驗組大鼠出現(xiàn)骨小梁面積減少,骨小梁厚度顯著變窄,骨小梁結(jié)點末端比下降,骨小梁間距增寬。電鏡下骨小梁之間缺乏有效連接,骨小梁明顯變薄、變細;骨小梁分離度加大,骨吸收的程度較深,發(fā)生穿孔,微裂紋和微骨折的微損傷明顯增多,表現(xiàn)為與人類骨質(zhì)疏松相似的病理變化,骨結(jié)構(gòu)衰敗。此必定會影響骨的力學性能,降低骨強度,加大骨折的危險性。骨代謝方面,DPD/Cr、PYD/Cr、BGP顯著升高,提示破骨細胞活性增加,與之偶聯(lián)的成骨細胞也功能活躍,骨轉(zhuǎn)化率增加,骨重建的骨吸收大于骨形成,最終導致骨量減少。而BALP升高不明顯其機制可能與全身骨轉(zhuǎn)換速率不同,與不同部位骨丟失程度不同有關(guān)。因此,膳食中過多的蛋白質(zhì)并且鈣質(zhì)不足會構(gòu)成骨質(zhì)疏松癥的危險因素。本實驗只在一個時間點上檢測骨代謝的生化變化,有必要在骨質(zhì)疏松不同階段動態(tài)地檢測其變化以闡明其變化規(guī)律。對骨小梁的形態(tài)學的研究也應在骨計量學上行動態(tài)觀測,使骨重建的變化有直觀、深入的理解。綜上所述,根據(jù)本實驗中骨計量學、代謝變化的情況,實驗組大鼠屬于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松,