谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制大鼠癲癇模型的構(gòu)建及其對突觸可電性的影響

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制大鼠癲癇模型的構(gòu)建及其對突觸可電性的影響

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一個(gè)特定的神經(jīng)退行性神經(jīng)退行性疾病，通常伴隨著初始神經(jīng)退行性疾病，通常伴隨著攻擊時(shí)的學(xué)習(xí)和記憶障礙。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的刺激性神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)傳輸?shù)囊徊糠?。在生理上，它可以參與神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)你的效率。病理?xiàng)l件下，血管生成的谷氨酸釋放也起著癲癇的作用。氨基糖轉(zhuǎn)移體（aet）是硝基和皮質(zhì)膜的糖蛋白。目前，有5種明確的谷氨酸轉(zhuǎn)移體（glast-ait1、glt-1、aea2、aec1、aet4、aet5）。在生理狀態(tài)下，谷氨酸轉(zhuǎn)移體清除細(xì)胞外的谷氨酸，并維持接觸之間的正常信號傳輸。在某些病理?xiàng)l件（如na）下，這些變化不僅可以改變表面成績，而且還會導(dǎo)致神經(jīng)毒性谷氨酸的釋放。谷氨酸和谷氨酸的轉(zhuǎn)移體共同影響細(xì)胞外的谷氨酸水平，以及神經(jīng)細(xì)胞的生化。星形糖細(xì)胞的巨大變化和苔蘚纖維的發(fā)芽。這些變化在癲癇的發(fā)病機(jī)制和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。對于攻擊和癲癇的過渡階段，ga3和racematga1、ga3和ga3方面的gademat-1以及gat-1內(nèi)囊泡內(nèi)的反應(yīng)性星形質(zhì)細(xì)胞的大小和顆粒的大小可以觀察到谷氨酸轉(zhuǎn)移體的變化。對于ca3和斜坡上的斜坡上的gaanwinch，以及gat-1內(nèi)囊泡內(nèi)的gaggal和意義改善。這些變化可以被認(rèn)為是對大量細(xì)胞失去的一種等價(jià)機(jī)制，以防止進(jìn)一步的細(xì)胞損失。在潛伏期，不同葉回頭顆粒和分子層的gaanwinch出現(xiàn)改善，但gaanwinch的長期影響，尤其是對自發(fā)攻擊后水位和動作電位的影響，在本實(shí)驗(yàn)中，采用了鈦-魯卡色癲癇模型，探討了鈉轉(zhuǎn)體對癲癇狀態(tài)下的影響，以及長期突變適應(yīng)性的影響。1材料和方法1.1大鼠癲癇模型的建立本實(shí)驗(yàn)采用雄性Wistar大鼠,體重(304.06±13.79)g(275～330g),由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供.建模前20h給予LiCl2,皮下注射匹魯卡品(Pilocarpine,Pilo,25mg/kg,Sigma,USA)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作.建模前30min給予硫酸阿托品(1mg/kg,i.p.),對抗匹魯卡品的外周膽堿能作用.癲癇發(fā)作持續(xù)30min以上視為建模成功,發(fā)作60min后給予安定(10mg/kg,i.p.)終止發(fā)作減少死亡率.Wistar大鼠32只隨機(jī)分為5組:短期癲癇實(shí)驗(yàn)組(SE)及其對照組(SC),長期癲癇實(shí)驗(yàn)組(LE)及其對照組(LC),健康大鼠對照組(Sham),大鼠建模14天后,30%烏拉坦(4ml/kg.i.p.)麻醉,手術(shù)暴露顱骨,立體定向引導(dǎo)在SE和LE組大鼠的右側(cè)海馬內(nèi)(前囟后3.1mm,右側(cè)2.5mm,深4.0mm)緩慢勻速注射(5min)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑TBOA(7.5nmol/1μl,Sigma,USA),及在SC和LC組大鼠的相同部位注射相同劑量人工腦脊液,留針15min.1.2腦立體定位圖譜大鼠給予TBOA2h(SE和SC組)及14天后(LE和LC組),30%烏拉坦(1.2g/kg)麻醉,固定于頭部立體定位儀(Narishige,Japan),檢測右側(cè)海馬內(nèi)嗅區(qū)前穿通纖維(PP)和海馬齒狀回(DG)之間長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)并記錄右側(cè)DG區(qū)EEG.依據(jù)Paxinos和Watson大鼠腦立體定位圖譜(1986年),記錄LTP時(shí),置于PP的刺激電極為前囟后8.0mm,中線旁4.4mm,置于DG的記錄電極位于前囟后4.2mm,中線旁2.5mm.用比較接近生理變化的theta頻率刺激(thetaburststimulation,TBS)誘導(dǎo)出LTP(PowerLab,Australian).記錄電極和刺激電極均緩慢插入,直到選一固定強(qiáng)度而能記錄出最大群體峰電位(populationspike,PS)的部位,調(diào)整刺激強(qiáng)度至記錄的電位反應(yīng)穩(wěn)定增加20%后,記錄15min低頻(0.1Hz,波寬0.1ms)誘導(dǎo)的反應(yīng)作為基礎(chǔ)值,再給予高頻刺激(10個(gè)4Hz的串刺激,每個(gè)串刺激有4個(gè)頻率為100Hz的單脈沖,TBS重復(fù)5次,每次間隔20s)誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)(LTP).記錄并保存刺激前15min至刺激后1h的反應(yīng),分析興奮性突觸后電位(EPSP)的斜率和PS的波寬.LTP記錄后,記錄DG區(qū)的EEG.1.3神經(jīng)元變性觀察電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠經(jīng)心臟灌流取腦,固定、脫水、包埋、石蠟切片(Leica,Germany),然后作特異性標(biāo)記神經(jīng)元變性的熒光染色,即Fluoro-Jade-B染色,觀察海馬區(qū)神經(jīng)元變性情況.1.4多因素方差分析實(shí)驗(yàn)各組LTP和EEG的數(shù)值都用均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(s)表示,組間差異使用多因素方差分析(ANOVA).P<0.05視為具有顯著性差異;P<0.01視為具有極顯著性差異.2結(jié)果2.1leebp的斜率興奮性突觸后電位(EPSP)的斜率:LC與Sham組相比,高頻刺激后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)EPSP的斜率顯著降低(P<0.05);LE與Sham組相比,HFS后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)EPSP的斜率顯著增加(P<0.01;P<0.05);LE與LC組相比,HFS后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)EPSP的斜率顯著增加(P<0.01;P<0.05),如圖1所示.2.2sc組與sc組0.100.32vv的比較計(jì)算海馬DG部位EEG的功率譜,theta波段能量顯示:給予谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑TBOA2h后SE組的theta波段能量下降(0.04±0.02)V2,與SC組(0.10±0.02)V2相比具有顯著性差異(P<0.05);給予TBOA14天后LE組EEG的theta波段能量(0.04±0.02)V2與LC組(0.03±0.01)V2相比已無顯著性差異.并且LCtheta波段能量較SC組明顯降低((0.10±0.02)V2和(0.03±0.01)V2,P<0.05),但是LE組與SE組相比未見此趨勢(圖3).2.3不同的tboa-轉(zhuǎn)運(yùn)體流量分布Fluoro-Jade-B染色是一種特異性標(biāo)記變性神經(jīng)元的熒光染色.如圖4所示:LE組,給予TBOA引起的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙,在給予TBOA2周后,齒狀回可見大量顆粒細(xì)胞變性(綠色熒光所示)(圖4a).LC組,給予人工腦脊液2周后,齒狀回顆粒細(xì)胞變性明顯少于LE組(較少的綠色熒光)(圖4b).3氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能異常與癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元/運(yùn)動區(qū)域神經(jīng)元/轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)系長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)是記憶的分子機(jī)制之一,本實(shí)驗(yàn)中用以衡量興奮性突觸后電位(EPSP)和群峰電位的變化,以了解癲癇潛伏期中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的作用及對自發(fā)發(fā)作期突觸可塑性的影響.DL-TBOA用于阻滯的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體包括分布在神經(jīng)元的EAAC1和膠質(zhì)細(xì)胞的GLT1與GLAST.相比于其他轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑,TBOA的優(yōu)勢在于:a.它是一類非轉(zhuǎn)運(yùn)性抑制劑,不降低遞質(zhì)釋放;b.它在電生理記錄和電泳條帶測定時(shí),沒有谷氨酸受體激動劑的作用.LTP的誘導(dǎo)和維持包含有NMDA受體介導(dǎo)的內(nèi)向Ca2+流,因此,EPSP的斜率改變不僅是突觸可塑性的改變,還提示相同的刺激將產(chǎn)生不同程度的Ca2+內(nèi)流.在癲癇的化學(xué)點(diǎn)燃模型中,點(diǎn)燃對LTP的幅值、極性和飽和度具有不同的影響.本實(shí)驗(yàn)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對LTP的影響也有類似結(jié)果,如圖1所見:LC組與Sham組相比,EPSP的斜率明顯降低,說明在癲癇病程中,機(jī)體上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá),降低EPSP的同步性即降低突觸后神經(jīng)元的可塑性,減少神經(jīng)元的Ca2+內(nèi)流以保護(hù)殘存神經(jīng)元.LE組EPSP的斜率不但高于LC組,甚至與正常對照Sham組相比也明顯增強(qiáng),說明阻滯谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體后,谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能障礙逆轉(zhuǎn)了這種趨勢,這樣的保護(hù)機(jī)制隨之消失,細(xì)胞承擔(dān)了更多的Ca2+超載,進(jìn)一步引起變性、凋亡/死亡及再生.換言之,正是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)了該機(jī)制.Fluoro-Jade-B染色顯示(圖4):在TBOA干預(yù)2周后,LE組的變性細(xì)胞明顯多于LC組,從病理學(xué)上證實(shí)上述推斷.相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告提出癲癇發(fā)作在海馬產(chǎn)生了一系列的變化,包括PP-DG傳導(dǎo)通路上谷氨酸能神經(jīng)元遞質(zhì)釋放的增加、神經(jīng)元的變性、死亡與再生的增加,苔蘚纖維出芽以及由此產(chǎn)生的突觸重組,而且在星型膠質(zhì)細(xì)胞,谷氨酸水平升高時(shí)反應(yīng)性逆行釋放谷氨酸,并借此調(diào)整谷氨酸能神經(jīng)元的神經(jīng)傳遞.由TBOA介導(dǎo)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙加強(qiáng)了上述變化.有研究報(bào)道,海馬齒狀回年輕、新生的顆粒細(xì)胞在海馬區(qū)突觸可塑性方面發(fā)揮著重要作用,正是這些新生細(xì)胞包括增生的膠質(zhì)細(xì)胞參與介導(dǎo)并增強(qiáng)了LTP的EPSP斜率,而EPSP斜率的增加又導(dǎo)致細(xì)胞更大的Ca2+超載并導(dǎo)致細(xì)胞變性,形成一個(gè)惡性循環(huán).群峰電位的寬度代表著某一腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元動作電位的同步性,本實(shí)驗(yàn)中,群峰電位的寬度在LE、LC和正常對照Sham組之間均無明顯變化,說明無論是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙還是癲癇病程對DG區(qū)域神經(jīng)元動作電位的同步性無明顯影響.theta波為海馬區(qū)生理腦電波集中的頻段,反映海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的活性.給予TBOA2h后,SE組的theta波段能量(0.04±0.02)V2較SC組(0.10±0.02)V2明顯下降,說明海馬區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體即時(shí)的功能障礙引起突觸間谷氨酸堆積,影響神經(jīng)元功能.在給予TBOA2周后,LE組在EEG功率譜theta波段能量(0.04±0.02)V2與LC組(0.03±0.01)V2相比已無顯著性差異,提示此時(shí)TBOA導(dǎo)致的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙對神經(jīng)元活動已無直接影響.SC組與LC組相比,兩次EEG功率譜theta波段能量隨時(shí)間下降,而在SE組和LE組卻沒有這樣的趨勢,反而在數(shù)值上略有上升.很有可能是新生細(xì)胞參與介導(dǎo)了LE組EEGtheta波段能量的增加.Fluoro-Jade-B染色結(jié)果證實(shí)了這一推測.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙導(dǎo)致LE組神經(jīng)元變性較LC組明顯增多,進(jìn)