尼龍與雞混合蟲的分離與鑒定

尼龍與雞混合蟲的分離與鑒定

通過對球蟲的分離和提取，我們可以識別球蟲的類型，建立球蟲的簡單序列系統(tǒng)，對進(jìn)一步研究球蟲的藥物效應(yīng)、抗性、寄生蟲和球蟲的適應(yīng)性具有極其重要的意義。為給理論上和生產(chǎn)實踐中球蟲課題提供可靠的依據(jù)。國內(nèi)學(xué)者對球蟲單卵囊的分離技術(shù)進(jìn)行過研究和報道,如田廣孚、田增義曾用5厘米高的DEAE-52纖維素柱,以PH為8.0的甘氨酸緩沖液作為洗滌液對柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行了提純。但因需特殊儀器,操作技術(shù)繁雜,且試劑價貴,一般設(shè)備條件根本無法辦到。我們經(jīng)過探索,得到設(shè)備要求不高,容易操作,一般實驗室均能進(jìn)行的雞球蟲卵囊的分離與純化方法。用本方法進(jìn)行堆型艾美耳球蟲卵囊純化孢子化后進(jìn)行鏡檢,純化率達(dá)90%以上。1材料表面1.1球蟲囊的收集從鳳陽縣農(nóng)戶散養(yǎng)雞群中,選擇具有球蟲病典型癥狀的病雞,收集新鮮糞便中的球蟲卵囊,為混合球蟲株。*安徽省科技廳重點項目(00023067)**本院2002屆畢業(yè)生顧有方:男,1964年出生,教授,博士,預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)1.2試劑2.5%重鉻酸鉀溶液,生理鹽水,2%瓊脂。1.3生物顯微鏡、分離針、受壓縮機(jī)、水分散液、水改性變應(yīng)變器的模擬采集檢查寄生蟲蟲卵常用的尼龍篩、平皿、雙目生物顯微鏡、分離針、刀片、組織搗碎勻漿機(jī)、TDL-5離心機(jī)、WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱、解剖器材、接種用注射器、橡膠管等。1.4試驗動物從本院附屬畜牧場購進(jìn)的一批健康的蛋公雞。2雞球囊腫的分離2.1沉淀物的提取收集球蟲病病雞的新鮮糞便,倒入塑料桶或搪瓷盆中,加入水浸泡,并用260目的尼龍篩進(jìn)行過濾,將得到的濾液靜置沉淀24h左右,倒去上清液,如此反復(fù)進(jìn)行幾次,最后,收集沉淀物。2.2卵囊的芽孢化率測定將上述沉淀物加入適量2.5%重鉻酸鉀溶液置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天攪拌一次,并補(bǔ)加適量2.5%重鉻酸鉀溶液,同時進(jìn)行鏡檢觀察卵囊的孢子化率。2.3不同濃度沉渣的幼雞感染孢子化的卵囊培養(yǎng)液用TDL-5離心機(jī)離心(30×100rpm,10分鐘)數(shù)次至上清液完全澄清,取沉渣飼喂雛雞,對感染后的雛雞采取嚴(yán)格隔離措施。注意觀察雞的精神狀態(tài)、飲食、飲水等情況,至第7天撲殺,取病雞小腸前段,用組織搗碎勻漿機(jī)磨碎,用2.5%重鉻酸鉀溶液置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),鏡檢觀察卵囊的孢子化率達(dá)70%~80%即可。2.4單囊球蟲的分離2.4.12%脂肪溶將1g瓊脂倒入100ml燒杯中,加水49ml,用水浴加熱法加熱至60~70℃,使瓊脂完全溶解,即成2%的瓊脂溶液。2.4.2球卵囊的觀察用滴管吸取2.5%重鉻酸鉀的球蟲卵囊培養(yǎng)液,滴5滴于試管內(nèi),加生理鹽水?dāng)?shù)毫升稀釋,直至在顯微鏡低倍鏡下觀察到每個視野中有1~2個球蟲卵囊為止。2.4.3球卵囊的分散在干燥清潔的載玻片上先滴1滴2%的瓊脂溶液,在液面上滴1滴稀釋好的球蟲卵囊液,再在上面滴1滴2%瓊脂溶液,將球蟲卵囊包埋,置載玻片于水平臺處,待瓊脂球蟲卵囊液在載玻片上自然凝固后,用低倍鏡檢查,以有3個以內(nèi)的球蟲卵囊分散在瓊脂內(nèi)為止。2.4.4瓊球卵囊分離用雙面刀片把載玻片上的球蟲卵囊瓊脂輕輕切割成小方塊,用分離針和刀片把分割出來的一個瓊脂球蟲卵囊小塊移至另一個載玻片上,在瓊脂球蟲卵囊小塊面上滴1滴水,然后逐塊從不同方位在低倍鏡下觀察,當(dāng)確定每個瓊脂球蟲卵囊塊內(nèi)只有一個孢子化球蟲卵囊時,雞球蟲單卵囊分離即達(dá)到目的。再用分離針和刀片把包埋有球蟲單卵囊的瓊脂塊移至凹面玻片凹窩中,滴加適量生理鹽水,放入平皿中備用。3球蟲囊的純度3.1球蟲單卵囊的雞體內(nèi)脂的制備將單卵囊分離好的小塊瓊脂飼喂15~20日齡的雛雞,感染方法為一人左手拿刀片,右手拿分離針,把含有球蟲單卵囊的瓊脂從凹面玻璃片上挑起,另一人用拇指和食指將雞嘴打開,把瓊脂塊小心撥到雞的喉部,然后用干燥清潔滴管吸取生理鹽水滴入雞嘴中,讓其咽下。3.2試驗雞的飼養(yǎng)按雛雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配飼料,確保飼料中不含有球蟲和抗球蟲成分。飼養(yǎng)籠用福爾馬林消毒暴曬后,感染試驗的雛雞單個飼養(yǎng)于籠中。試驗期間飲水避免因外源性球蟲感染而影響試驗結(jié)果。在感染球蟲單卵囊數(shù)小時前雛雞只飲水,感染后才喂飼料。從感染后第四天開始,檢查糞便,詳細(xì)觀察記錄,球蟲在雛雞體內(nèi)的潛伏期,臨床癥狀以及球蟲卵囊隨糞便排出的情況。3.3磨碎機(jī)研磨化取發(fā)病雞小腸前段及其內(nèi)容物,用組織搗碎機(jī)磨碎,用2.5%重鉻酸鉀溶液連同磨碎物于平皿內(nèi)置28℃恒溫培養(yǎng)箱孢子化,至完成孢子化后結(jié)合鏡檢判斷。4剖檢和飲水異常經(jīng)純化后的孢子化的卵囊接種雞,感染后經(jīng)3天潛伏期,鏡檢糞便有少量卵囊,剖檢尚無明顯病理變化;第4天有水樣糞便排出,同時混有未消化的飼料,剖檢時,在十二指腸和小腸前段的粘膜上出現(xiàn)少量點線狀的灰白色壞死灶,這種特征性病變隨感染時間的延長而加重;第6天左右,食欲稍減退,糞便呈細(xì)長面條狀,外裹有粘液,此時起雞有強(qiáng)烈的飲水欲;第7天撲殺,取腸粘膜上有大量點線狀的灰白色壞死灶或偶有少量白點的小腸前段,其孢子化后的卵囊在顯微鏡下觀察,形狀以卵形為主,偶有卵囊為球形或卵圓形,在顯微鏡下用測微器測得卵囊大小(微米)20.1-17.6×16.2-13.6。5球卵囊的測定5.1雞球蟲的卵囊,只有大小的差別,因此僅僅根據(jù)糞便中卵囊來判定蟲種是比較困難的。但本次試驗主要根據(jù)不同種寄生蟲主要寄生部位不同,收集新生的卵囊,待形成孢子化后,進(jìn)行單卵囊鑒定,回歸試驗解剖發(fā)病雞的典型癥狀,如小腸內(nèi)壁的細(xì)微狀白點,即可初步判斷為堆型艾美耳球蟲的純種。再結(jié)合孢子化的卵囊外部形態(tài)如卵形,卵囊的最短孢子化時間為21h,則可判斷其卵囊為堆形艾美耳球蟲的卵囊。5.2收集到的卵囊用2.5%重鉻酸鉀溶液培養(yǎng)球蟲卵囊的效果很好,這是因為重鉻酸鉀既能抑制其它微生物的生長繁殖,又可持久地保持球蟲卵囊的形態(tài)完整和生命力,而用飽和食鹽水中培養(yǎng)的球蟲卵囊,由于濃度高,1~2后即發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊皺縮、變形,從而影響球蟲單卵囊的分。5.3用2%瓊脂包埋球蟲卵囊較為理想。瓊脂熔點不高,以球蟲卵囊影響不大,同時瓊脂透明,不