面上項(xiàng)目標(biāo)書(shū)范例

申請(qǐng)代碼H1606受理部門(mén)收件日期受理編號(hào)國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書(shū)()您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請(qǐng)根據(jù)下列三個(gè)環(huán)節(jié)操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顧客，請(qǐng)把Word宏的安全性設(shè)為:"中"辦法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級(jí),設(shè)立為"中"(如果您是Word97顧客，繼續(xù)執(zhí)行下列環(huán)節(jié))(如果您是Office顧客，點(diǎn)擊word左上角"安全警告"處"選項(xiàng)"中的"啟用此內(nèi)容")2)關(guān)閉本文檔，重新打開(kāi)本文檔3)點(diǎn)擊"啟用宏"按鈕，即可開(kāi)始填寫(xiě)本文檔或打印了您現(xiàn)在不能檢查保護(hù)文檔或打印文檔，請(qǐng)根據(jù)下列三個(gè)環(huán)節(jié)操作：1)如果您是Word,wordXP,word或以上版本顧客，請(qǐng)把Word宏的安全性設(shè)為:"中"辦法:Word菜單->工具->宏->安全性->安全級(jí),設(shè)立為"中"(如果您是Word97顧客，繼續(xù)執(zhí)行下列環(huán)節(jié))(如果您是Office顧客，點(diǎn)擊word左上角"安全警告"處"選項(xiàng)"中的"啟用此內(nèi)容")2)關(guān)閉本文檔，重新打開(kāi)本文檔3)點(diǎn)擊"啟用宏"按鈕，即可開(kāi)始填寫(xiě)本文檔或打印了亞類(lèi)闡明：附注闡明：項(xiàng)目名稱(chēng)：Pyk2增進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的一種新的分子機(jī)制研究：結(jié)合并磷酸化E-cadherin?申請(qǐng)人：電話(huà)：依靠單位：通訊地址：郵政編碼：266021單位電話(huà)：電子郵箱：申報(bào)日期：201FORMTEXT0年FORMTEXT2月FORMTEXT26日國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)

基本信息yoKWT/OQ申請(qǐng)人信息姓名性別男出生年月1973年4月民族漢族學(xué)位博士職稱(chēng)副主任醫(yī)師每年工作時(shí)間（月）8電話(huà)電子郵箱傳真國(guó)別或地區(qū)中國(guó)個(gè)人通訊地址工作單位重要研究領(lǐng)域腫瘤分子生物學(xué)依靠單位信息名稱(chēng)聯(lián)系人電子郵箱電話(huà)網(wǎng)站地址合作研究單位信息單位名稱(chēng)項(xiàng)目基本信息項(xiàng)目名稱(chēng)資助類(lèi)別面上項(xiàng)目亞類(lèi)闡明附注闡明申請(qǐng)代碼H1606:腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移H1617:消化系統(tǒng)腫瘤基地類(lèi)別研究年限1月—12月研究屬性基礎(chǔ)研究申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)35.0000萬(wàn)元摘要(限400字)：FORMTEXTE-cadherin的喪失與肝癌轉(zhuǎn)移親密有關(guān)。其喪失的重要因素是由于其酪氨酸殘基被磷酸化后蛋白被降解。我們通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)一種新的能與E-cadherin互相作用的非受體型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增強(qiáng)可增進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移。本課題假設(shè)Pyk2結(jié)合并磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白降解，細(xì)胞遷移性增加。本課題設(shè)計(jì)首先通過(guò)GSTpulldown、免疫共沉淀證明兩者互相作用可靠；另首先通過(guò)磷酸化實(shí)驗(yàn)確證Pyk2能夠磷酸化E-cadherin；然后應(yīng)用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)擬定：Pyk2通過(guò)磷酸化E-cadherin而影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移；最后分析在人肝癌標(biāo)本中兩者體現(xiàn)的有關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2能夠直接磷酸化E-cadherin，增進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移，含有國(guó)際先進(jìn)性。這對(duì)于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制有新的理解，對(duì)于藥品研發(fā)提供新的思路。關(guān)鍵詞(用分號(hào)分開(kāi)，最多5個(gè))FORMTEXT肝癌；E-cadherin；Pyk2；腫瘤轉(zhuǎn)移經(jīng)費(fèi)申請(qǐng)表（金額單位：萬(wàn)元）科目申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)備注（計(jì)算根據(jù)與闡明）一.研究經(jīng)費(fèi)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb3:b3)+sum(tbl_budgetb9:b9)+sum(tbl_budgetb12:b12)+sum(tbl_budgetb15:b16)28.7528.7500FORMTEXT1.科研業(yè)務(wù)費(fèi)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb4:b8)7.67.6000FORMTEXT（1）測(cè)試/計(jì)算/分析費(fèi)FORMTEXT2.1000FORMTEXTDNA測(cè)序，生物信息分析，統(tǒng)計(jì)分析（2）能源/動(dòng)力費(fèi)FORMTEXTFORMTEXT1FORMTEXT（3）會(huì)議費(fèi)/差旅費(fèi)FORMTEXT1.0000FORMTEXT參加學(xué)術(shù)會(huì)議3-4人次（4）出版物/文獻(xiàn)/信息傳輸費(fèi)FORMTEXT3.0000FORMTEXT文獻(xiàn)檢索，發(fā)表論文，專(zhuān)利申請(qǐng)（5）其它FORMTEXT1.5000FORMTEXT成果鑒定2.實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb10:b11)21.1521.1500FORMTEXT（1）原材料/試劑/藥品購(gòu)置費(fèi)FORMTEXT17.1500FORMTEXT多個(gè)試劑盒，脂質(zhì)體，抗體，細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)耗材（2）其它FORMTEXT4.0000FORMTEXT動(dòng)物喂養(yǎng)，臨床調(diào)研3.儀器設(shè)備費(fèi)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb13:b14)00.0000FORMTEXT（1）購(gòu)置FORMTEXTFORMTEXT（2）試制FORMTEXTFORMTEXT4.實(shí)驗(yàn)室改裝費(fèi)FORMTEXTFORMTEXT5.協(xié)作費(fèi)FORMTEXTFORMTEXT二.國(guó)際合作與交流費(fèi)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb18:b19)1.51.5000FORMTEXT1.項(xiàng)目構(gòu)組員出國(guó)合作交流FORMTEXTFORMTEXT2.境外專(zhuān)家來(lái)華合作交流FORMTEXT1.5000FORMTEXT邀請(qǐng)美國(guó)康奈爾大學(xué)關(guān)軍林專(zhuān)家合作交流三.勞務(wù)費(fèi)FORMTEXT3.0000FORMTEXT碩士加班補(bǔ)貼四.管理費(fèi)FORMTEXT1.7500FORMTEXT5%管理費(fèi)合計(jì)FORMTEXT=sum(tbl_budgetb2:b2)+sum(tbl_budgetb17:b17)+sum(tbl_budgetb20:b21)3535.0000FORMTEXT與本項(xiàng)目有關(guān)的

其它經(jīng)費(fèi)來(lái)源國(guó)家其它計(jì)劃資助經(jīng)費(fèi)FORMTEXT其它經(jīng)費(fèi)資助（含部門(mén)匹配）FORMTEXT其它經(jīng)費(fèi)來(lái)源累計(jì)FORMTEXT=sum(tbl_budgetc23:c24)00.0000 報(bào)告正文一、立項(xiàng)根據(jù)與研究?jī)?nèi)容：（一）項(xiàng)目的立項(xiàng)根據(jù)原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)的肝癌發(fā)病數(shù)占全球全部肝癌病例的二分之一左右，因此我國(guó)對(duì)于肝癌的研究顯得非常迫切[1]。肝癌非常容易轉(zhuǎn)移，其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是治療失敗的重要因素。理解肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的有關(guān)機(jī)制，對(duì)于設(shè)計(jì)合理的治療藥品，進(jìn)一步提高我國(guó)肝癌的治療水平含有重要意義[2]。E-cadherin在肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中起到了不可無(wú)視的作用。E-cadherin屬于鈣粘附蛋白家族(Cadherin家族)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附反映，介導(dǎo)細(xì)胞間的接觸克制和凋亡等方面發(fā)揮重要作用。E-cadherin與β-catenin、p120等形成復(fù)合體發(fā)揮上述功效[3]。E-cadherin與多個(gè)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移親密有關(guān)[4-5]。有人認(rèn)為提高E-cadherin的體現(xiàn)能夠成為腫瘤治療的一種方向[6]。與其它腫瘤類(lèi)似，研究表明E-cadherin在肝細(xì)胞癌的陽(yáng)性率明顯低于癌旁組織及正常肝組織，體現(xiàn)越低則腫瘤病理分級(jí)越差，也越容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[7-9]。有人報(bào)道缺少E-cadherin體現(xiàn)的人肝癌細(xì)胞株非常容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，但是轉(zhuǎn)染E-cadherin后這種特性發(fā)生逆轉(zhuǎn)，闡明E-cadherin在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[10]。E-cadherin喪失或低體現(xiàn)的機(jī)制至今仍然不是完全清晰。現(xiàn)在認(rèn)為可能是由于基因突變?cè)斐晒π适?、啟?dòng)子甲基化后轉(zhuǎn)錄沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亞洲人群中基因突變和啟動(dòng)子甲基化都不常見(jiàn)[12-13]。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文獻(xiàn)證明，酪氨酸殘基磷酸化的E-cadherin能夠與Hakai（一種E3泛素連接酶）結(jié)合，使其泛素化而降解[14]。那么有多少酪氨酸激酶參加這個(gè)機(jī)制呢？有報(bào)道EGFR，IGF-1R能夠磷酸化E-cadherin。對(duì)于E-cadherin磷酸化的調(diào)節(jié)機(jī)制現(xiàn)在仍然不是非常明確。為理解E-cadherin在肝癌細(xì)胞的分子信號(hào)通路，我們以E-cadherin（胞內(nèi)段）為誘餌應(yīng)用酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）在肝臟的cDNA文庫(kù)中篩選到一種新的能與E-cadherin互相作用的非受體型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2與否能磷酸化E-cadherin并調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移呢？Pyk2(prolinerichtyrosinekinase2)是一種富含脯氨酸的非受體型酪氨酸蛋白激酶，與FAK同源度較高，屬于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和遷移[16]方面受到越來(lái)越多的關(guān)注。Pyk2信號(hào)通路的活化能夠增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，研究發(fā)現(xiàn)Pyk2在多個(gè)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明，Pyk2在59%的肝癌組織中體現(xiàn)上調(diào)，Pyk2高體現(xiàn)與肝癌組織體積、Edmonson分級(jí)呈正有關(guān)，Pyk2體現(xiàn)越高病人預(yù)后越差。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示在侵襲邊沿的肝癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移到肺結(jié)節(jié)中的肝癌細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)Pyk2高體現(xiàn)。肝癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Pyk2后，其遷移功效增強(qiáng)；而用裸鼠做實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)克制Pyk2的活性后肝癌腫瘤的大小和肺轉(zhuǎn)移率都較對(duì)照明顯減少[19-20]。Pyk2調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制是什么呢？有研究表明，在肝癌細(xì)胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，與c-Src形成復(fù)合體激活ERK通路，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲性[19-20]；也有報(bào)道Pyk2與PECAM-1（血小板/內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子，與E-cadherin同樣都屬于鈣粘附蛋白家族）結(jié)合并且都影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性[21]；尚有報(bào)道RhoC通過(guò)激活Pyk2增進(jìn)前列腺癌轉(zhuǎn)移[18]以及與SOCS3、Cyr61有關(guān)等[22-23]。總而言之，現(xiàn)在Pyk2調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制仍不十分清晰。Pyk2與E-cadherin能否結(jié)合并調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移呢？這是我們想要研究的問(wèn)題。我們繼續(xù)應(yīng)用酵母雙雜交重復(fù)驗(yàn)證、GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀證明兩者互相作用是可靠的（具體成果見(jiàn)研究基礎(chǔ)）。那么，現(xiàn)在的問(wèn)題是兩者在體內(nèi)狀態(tài)下與否結(jié)合？結(jié)合后的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么？?jī)烧叩慕Y(jié)合位點(diǎn)在什么地方？結(jié)合后如何調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移以及影響腫瘤轉(zhuǎn)移？考慮到Pyk2是一種激酶蛋白，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)E-cadherin與Pyk2的激酶部分結(jié)合，因此有兩種可能性。一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種就是E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。有文獻(xiàn)報(bào)道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族組員）并且克制其與Catenin，P120等形成復(fù)合體[24-25]。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)當(dāng)也有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測(cè)，由于腫瘤始動(dòng)因素的作用，Pyk2體現(xiàn)增多，活性增強(qiáng)，從而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。但是也不能排除第二種可能性，E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性，從而造成腫瘤細(xì)胞侵襲性下降。申請(qǐng)人以前的工作就發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一種組員γ-Protocadherins能夠克制Pyk2的活性[26]，申請(qǐng)人做這方面工作時(shí)曾取E-cadherin做對(duì)比參考，成果發(fā)現(xiàn)克制Pyk2激酶活性不是很明顯（本數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此不支持第二種可能性。兩者具體如何調(diào)節(jié)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。本課題的設(shè)計(jì)重要是為理解答上述問(wèn)題。首先在前期工作基礎(chǔ)上繼續(xù)明確Pyk2與E-cadherin能互相作用以及調(diào)節(jié)機(jī)制；另首先應(yīng)用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)擬定兩者的調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲性的影響；然后應(yīng)用裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)明確兩者的調(diào)節(jié)在對(duì)肝癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響；最后分析在肝癌病人組織標(biāo)本中兩者體現(xiàn)的有關(guān)性以及與轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。本課題在國(guó)際上最新發(fā)現(xiàn)Pyk2與E-cadherin直接互相作用，并且擬定其結(jié)合機(jī)制，明確這種調(diào)節(jié)與肝癌細(xì)胞遷移力和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。這對(duì)于肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的復(fù)雜機(jī)制有新的理解。許多新型抗癌藥品如赫賽汀、格列衛(wèi)、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶為治療靶點(diǎn)，獲得非常好的療效。本研究對(duì)于擬定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做為分子治療靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)合理的治療藥品能夠提供更有利的素材。參考文獻(xiàn)：[1]HeJ,GuD,WuX,etal.MajorcausesofdeathamongmenandwomeninChina.NEnglJMed;353:1124–34.[2]吳孟超，廖美琳，陸嘉德常見(jiàn)惡性腫瘤治療進(jìn)展上?？萍冀逃霭嫔鏪3]BryantDM,StowJL.TheinsandoutsofE-cadherintrafficking.TrendsCellBiol.Aug;14(8):427-34[4]WellsA,YatesC,ShepardCR.E-cadherinasanindicatorofmesenchymaltoepithelialrevertingtransitionsduringthemetastaticseedingofdisseminatedcarcinomas.ClinExpMetastasis.;25(6):621-8.EpubJul4[5]SalonC,LantuejoulS,EyminB,etal.TheE-cadherin-beta-catenincomplexanditsimplicationinlungcancerprogressionandprognosis.FutureOncol.Oct;1(5):649-60[6]HowardEW,CammKD,WongYC,etal.E-cadherinupregulationasatherapeuticgoalincancertreatment.MiniRevMedChem.May;8(5):496-518.[7]GuoC,LiuQG,YangW,etal.Relationamongp130Cas,E-cadherinandbeta-cateninexpression,clinicopathologicsignificanceandprognosisinhumanhepatocellularcarcinoma.HepatobiliaryPancreatDisInt.Oct;7(5):490-6.[8]ZhaiB,YanHX,LiuSQ,etal.ReducedexpressionofE-cadherin/catenincomplexinhepatocellularcarcinomas.WorldJGastroenterol.Oct7;14(37):5665-73.[9]FransveaE,AngelottiU,AntonaciS,etal.Blockingtransforminggrowthfactor-betaup-regulatesE-cadherinandreducesmigrationandinvasionofhepatocellularcarcinomacells.Hepatology.May;47(5):1557-66.[10]OsadaT,SakamotoM,InoY,etal.E-cadherinisinvolvedintheintrahepaticmetastasisofhepatocellularcarcinoma.Hepatology.1996Dec;24(6):1460-7[11]AuerkariEI.Methylationoftumorsuppressorgenesp16(INK4a),p27(Kip1)andE-cadherinincarcinogenesis.OralOncol.Jan;42(1):5-13.[12]WeiY,VanNhieuJT,PrigentS,etal.AlteredexpressionofE-cadherininhepatocellularcarcinoma:Correlationswithgeneticalterations,β-cateninexpression,andclinicalfeaturesHepatology

Sep;36(3):692-701[13]YuJ,NiM,XuJ,etal.Methylationprofilingoftwentypromoter-CpGislandsofgeneswhichmaycontributetohepatocellularcarcinogenesis.BMCCancer,2:29[14]FujitaY,KrauseG,ScheffnerM,Hakai,etal.Hakai,ac-Cbl-likeprotein,ubiquitinatesandinducesendocytosisoftheE-cadherincomplex.NatCellBiol.Mar;4(3):222-31.[15]McLachlanRW,YapAS.Notsosimple:thecomplexityofphosphotyrosinesignalingatcadherinadhesivecontacts.JMolMed85:545-554.[16]AvrahamH,ParkSY,SchinkmannK,etal.RAFTK/Pyk2-mediatedcellularsignalling.CellSignal.Mar;12(3):123-33.[17]BehmoaramE,BijianK,JieS,etal.Focaladhesionkinase-relatedproline-richtyrosinekinase2andfocaladhesionkinaseareco-overexpressedinearly-stageandinvasiveErbB-2-positivebreastcancerandcooperateforbreastcancercelltumorigenesisandinvasiveness.AmJPathol.Nov;173(5):1540-50.[18]IiizumiM,BandyopadhyayS,PaiSK,etal.RhoCpromotesmetastasisviaactivationofthePyk2pathwayinprostatecancer.CancerRes.Sep15;68(18):7613-20.[19]SunCK,ManK,NgKT,etal.Proline-richtyrosinekinase2(Pyk2)promotesproliferationandinvasivenessofhepatocellularcarcinomacellsthroughc-Src/ERKactivation.Carcinogenesis.Nov;29(11):2096-105.[20]SunCK,NgKT,SunBS,etal.Thesignificanceofproline-richtyrosinekinase2(Pyk2)onhepatocellularcarcinomaprogressionandrecurrence.BrJCancer.Jul2;97(1):50-7.[21]ZhangX,XuLH,YuQ.CellaggregationinducesphosphorylationofPECAM-1andPyk2andpromotestumorcellanchorage-independentgrowth.MolCancer.Jan14;9:7[22]ZhangS,GuoD,JiangL,etal.SOCS3inhibitingmigrationofA549cellscorrelateswithPYK2signalinginvitro.BMCCancer.;8:150.[23]VitaleG,GentiliniD,AbbruzzeseA,etal.Pyk2andCyr61atthecross-roadofcAMP-dependentsignallingininvasivenessandneuroendocrinedifferentiationofprostatecancer.CancerBiolTher.;8[24]TurowskiP,MartinelliR,CrawfordR,etal.Phosphorylationofvascularendothelialcadherincontrolslymphocyteemigration.JCellSci.Jan1;121(Pt1):29-37.[25]PotterMD,BarberoS,ChereshDA.TyrosinephosphorylationofVE-cadherinpreventsbindingofp120-andbeta-cateninandmaintainsthecellularmesenchymalstate.JBiolChem.Sep9;280(36):31906-12.[26]JianChen,LuY,MengS,etal.alpha-andgamma-ProtocadherinsNegativelyRegulatePYK2.JBiolChem.Jan30;284(5):2880-90

（二）項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目的,以及擬解決的核心科學(xué)問(wèn)題。１.重要研究?jī)?nèi)容1）擬定E-cadherin與Pyk2體外、體內(nèi)互相作用、作用位點(diǎn)以及調(diào)節(jié)關(guān)系。A．取E-cadherin與Pyk2不同構(gòu)造域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的辦法擬定兩者互相作用的構(gòu)造域，以及作用位點(diǎn)。B.選用兩者體現(xiàn)量都適中的肝癌組織，行內(nèi)源性免疫共沉淀，證明在體內(nèi)兩者也互相作用。C.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和蔗糖密度梯度超速離心辦法分析細(xì)胞組分的辦法擬定E-cadherin與Pyk2在細(xì)胞中共定位。D.應(yīng)用磷酸化實(shí)驗(yàn)，擬定E-cadherin與否是Pyk2的底物，應(yīng)用定點(diǎn)突變的辦法，擬定酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。（同時(shí)再次確證E-cadherin能否影響Pyk2激酶活性。）2）從細(xì)胞水平擬定Pyk2對(duì)E-cadherin的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞遷移。A.篩選Pyk2穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株，然后應(yīng)用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)體現(xiàn)Pyk2的細(xì)胞其遷移性、侵襲性的變化，檢測(cè)過(guò)體現(xiàn)Pyk2時(shí)E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的變化，擬定Pyk2對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)影響細(xì)胞遷移。B.取高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株MHCC97-H、HCCLM3(購(gòu)自上海中山醫(yī)院肝癌研究所)，應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默Pyk2的體現(xiàn)，觀察細(xì)胞遷移性、侵襲性的變化，檢測(cè)對(duì)應(yīng)狀態(tài)下E-cadherin的磷酸化狀態(tài)和體現(xiàn)水平的變化。從相反方向擬定Pyk2的體現(xiàn)克制后對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)，以及這種調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞遷移的影響。3）從動(dòng)物模型水平擬定Pyk2對(duì)E-cadherin的調(diào)節(jié)影響腫瘤轉(zhuǎn)移。應(yīng)用Pyk2穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株接種裸鼠，觀察裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移肝轉(zhuǎn)移狀況，分析Pyk2的過(guò)體現(xiàn)對(duì)E-cadherin磷酸化狀態(tài)的調(diào)節(jié)關(guān)系，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。4）從肝癌病人標(biāo)本中尋找Pyk2與E-cadherin磷酸化狀態(tài)的有關(guān)性，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的的有關(guān)性。收集肝癌標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化和Western等辦法擬定Pyk2的體現(xiàn)水平的變化與E-cadherin磷酸化狀態(tài)和蛋白水平的有關(guān)性，以及兩者與腫瘤轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。２.研究目的1）擬定Pyk2結(jié)合E-cadherin互相作用的構(gòu)造域及磷酸化位點(diǎn)，并闡明其調(diào)節(jié)機(jī)制。2）擬定Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)可影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。３.擬解決的核心科學(xué)問(wèn)題E-cadherin酪氨酸殘基的磷酸化造成其被降解，增加細(xì)胞侵襲性。本課題能夠擬定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2與E-cadherin的調(diào)節(jié)與否是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新的分子機(jī)制。（三）擬采用的研究方案及可行性分析。１.研究辦法GST-pulldown，熒光共定位，內(nèi)源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速離心，磷酸化實(shí)驗(yàn)，定點(diǎn)突變，穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株的篩選，RNAi克制Pyk2體現(xiàn)，細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，免疫組化，定量PCR，Western檢測(cè)等。２.核心技術(shù)闡明：1）磷酸化實(shí)驗(yàn)首先應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為陽(yáng)性參考，以純化的GST-E-cadherin蛋白為底物，以GST蛋白作為陰性對(duì)照，觀察Pyk2與否能夠磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin則應(yīng)用生物信息分析，定點(diǎn)突變，尋找磷酸化位點(diǎn)；如果不能磷酸化E-cadherin，則以通用底物E4Y1作為底物，加入不同量的E-cadherin觀察與否能夠影響Pyk2的激酶活性。2）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)首先分別用空載體PCDNA3.1，PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株（PRNK為Pyk2的C段，為Pyk2的失活突變體），用G418篩選出穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株。并檢測(cè)穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株P(guān)yk2蛋白體現(xiàn)量的不同。然后應(yīng)用穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株做Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，比較細(xì)胞遷移率的變化；檢測(cè)細(xì)胞遷移率的變化與Pyk2蛋白體現(xiàn)量的關(guān)系。同時(shí)取對(duì)應(yīng)細(xì)胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測(cè)磷酸化狀態(tài)來(lái)比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化以及這些變化與腫瘤遷移的關(guān)系，與Pyk2蛋白體現(xiàn)量的關(guān)系。3）裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)取上述三組穩(wěn)定體現(xiàn)細(xì)胞株分別接種裸鼠，待腫瘤直徑約1-1.5cm時(shí)取出腫瘤重新接種于另外一批裸鼠的肝左葉。接種5星期左右處死裸鼠，收集肝臟和肺臟，觀察肝內(nèi)轉(zhuǎn)移狀況和肺轉(zhuǎn)移狀況。檢測(cè)三組腫瘤Pyk2蛋白體現(xiàn)量的不同以及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。同時(shí)取對(duì)應(yīng)腫瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗體檢測(cè)磷酸化狀態(tài)來(lái)比較E-cadherin在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平、磷酸化水平的變化，擬定這些變化與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，與Pyk2蛋白體現(xiàn)量的關(guān)系。4）蔗糖密度梯度超速離心定位和內(nèi)源免疫共沉淀取肝癌腫瘤的癌旁組織，裂解離心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速離心。取離心后的不同組分樣品做Western，分別用E-cadherin抗體和Pyk2抗體作為一抗檢測(cè)。如果兩者體現(xiàn)最多的峰值是在同一種組分中，則提示我們兩者在細(xì)胞內(nèi)是共定位的。取上述兩者的體現(xiàn)較多的組分，用Pyk2單抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作對(duì)照），然后用E-cadherin單抗雜交檢測(cè)E-cadherin與否能與Pyk2共沉淀下來(lái)。相反方向則是：用E-cadherin單抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作對(duì)照），然后用Pyk2單抗雜交檢測(cè)Pyk2與否能與E-cadherin共沉淀下來(lái)。３.技術(shù)路線(xiàn)（見(jiàn)下圖）定點(diǎn)突變，定點(diǎn)突變，GST-pulldown，免疫共沉淀等辦法驗(yàn)證擬定互相作用的構(gòu)造域以及位點(diǎn)熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等辦法驗(yàn)證在細(xì)胞以及腫瘤組織中共定位收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料免疫組化、Western等辦法檢測(cè)E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2體現(xiàn)量的有關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。磷酸化實(shí)驗(yàn)擬定E-cadherin與否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點(diǎn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):測(cè)Pyk2蛋白過(guò)體現(xiàn)和RNAi克制時(shí)與E-cadherin磷酸化水平、細(xì)胞遷移的關(guān)系。篩選穩(wěn)定體現(xiàn)Pyk2肝癌細(xì)胞株，檢測(cè)Pyk2蛋白體現(xiàn)量與E-cadherin磷酸化水平的關(guān)系。裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):Pyk2蛋白體現(xiàn)量、E-cadherin磷酸化水平與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。匯總分析數(shù)據(jù)：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin機(jī)制；揭示Pyk2通過(guò)磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。左側(cè)部分：取E-cadherin與Pyk2不同構(gòu)造域和不同突變體，應(yīng)用酵母雙雜交、GST-PullDown以及免疫共沉淀的辦法擬定兩者互相作用的構(gòu)造域，以及作用位點(diǎn)。熒光共定位，免疫組化，蔗糖密度梯度超速離心等辦法驗(yàn)證兩者在細(xì)胞以及腫瘤組織中共定位；磷酸化實(shí)驗(yàn)擬定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位點(diǎn)。這部分內(nèi)容從生化的角度擬定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子機(jī)制。中間部分：通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平、動(dòng)物模型擬定：Pyk2通過(guò)磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。右側(cè)部分：收集肝癌病人標(biāo)本和臨床資料，通過(guò)免疫組化、Western等辦法檢測(cè)E-cadherin/Pyk2蛋白水平、磷酸化狀態(tài)，分析兩者體現(xiàn)量的有關(guān)性，以及與肝癌轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。最下面部分為匯總數(shù)據(jù)，總結(jié)分析。4.可行性分析前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)從酵母雙雜交、GST-PullDown、免疫共沉淀等證明了E-cadherin與Pyk2互相作用(見(jiàn)研究基礎(chǔ)部分)，并且兩者功效上親密有關(guān)。E-cadherin作為一種細(xì)胞黏附分子在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和接觸克制方面含有作用。而Pyk2能通過(guò)多個(gè)信號(hào)途徑參加調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和遷移等過(guò)程。因此，兩者在功效上是有互相作用基礎(chǔ)的。考慮到Pyk2是一種激酶蛋白，且前期實(shí)驗(yàn)成果提示Pyk2激酶區(qū)域結(jié)合E-cadherin，因此有兩種可能，一種是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一種是E-cadherin克制Pyk2激酶活性。我們認(rèn)為第一種可能性較大。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且克制其與Catenin、P120等形成復(fù)合體，從而影響細(xì)胞遷移。E-cadherin與VE-cadherin同源性很高，理化性質(zhì)相似，Pyk2能夠磷酸化VE-cadherin應(yīng)當(dāng)就有可能磷酸化E-cadherin。因此我們有理由推測(cè)，由于腫瘤始動(dòng)因素的作用，Pyk2體現(xiàn)增多，活性增強(qiáng)，從而磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin降解，最后使細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。我們上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本基于這個(gè)邏輯。磷酸化實(shí)驗(yàn)證明Pyk2磷酸化E-cadherin，造成E-cadherin蛋白減少。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)邏輯是通過(guò)Pyk2過(guò)體現(xiàn)，檢測(cè)E-cadherin磷酸化增強(qiáng)，蛋白量減少，造成細(xì)胞遷移增強(qiáng)或者腫瘤轉(zhuǎn)移增加；RNAi克制Pyk2的體現(xiàn)，則出現(xiàn)相反的成果，E-cadherin磷酸化削弱，蛋白量增加，造成細(xì)胞侵襲性削弱和腫瘤肺轉(zhuǎn)移減少。事實(shí)與否如此，需要實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。申請(qǐng)人以前的工作曾發(fā)現(xiàn)鈣粘附蛋白家族的另外一種組員γ-Protocadherins能夠克制Pyk2的活性，因此從邏輯上講也不能完全排除第二種可能性，即E-cadherin克制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是這樣的話(huà)，則可能的假設(shè)是：在正常細(xì)胞中，E-cadherin克制Pyk2的活性，在腫瘤條件下，由于其它因素E-cadherin減少或消失，而不能克制Pyk2活性，造成Pyk2活性增強(qiáng)，因而腫瘤細(xì)胞遷移性增強(qiáng)。如果基于這個(gè)邏輯的話(huà)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就要變化為：磷酸化實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作為底物，觀察E-cadherin對(duì)Pyk2激酶活性與否有克制作用。然后篩選E-cadherin過(guò)體現(xiàn)、功效失活突變體和空載體的穩(wěn)定體現(xiàn)肝癌細(xì)胞株，然后行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察E-cadherin蛋白過(guò)體現(xiàn)或功效失活突變后與細(xì)胞遷移或者腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，同時(shí)檢測(cè)其與Pyk2蛋白體現(xiàn)量及磷酸化水平有關(guān)性。但是申請(qǐng)人在完畢γ-Protocadherins克制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做對(duì)比參考，成果發(fā)現(xiàn)E-cadherin克制Pyk2激酶活性不是很明顯，因此這種可能性不大。從上面的分析來(lái)看，本課題在理論和邏輯上是可行的。2）本課題是本人前期工作的延續(xù)，本人對(duì)E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作構(gòu)建的質(zhì)粒體現(xiàn)載體等為本課題的下一步研究提供了諸多有利的條件。本課題組的組員對(duì)所需要的技術(shù)辦法都很純熟，且都有對(duì)應(yīng)的工作基礎(chǔ)，能夠在各個(gè)方面進(jìn)行協(xié)作。3）本課題所涉及的技術(shù)均為較成熟的技術(shù)，所需的設(shè)備和條件本校都含有。（四）本課題的特色與創(chuàng)新之處1.本課題通過(guò)酵母雙雜交新發(fā)現(xiàn)一種與E-cadherin互相作用的蛋白--非受體型酪氨酸激酶Pyk2，并證明兩者的互相作用可靠，國(guó)內(nèi)外研究至今未曾見(jiàn)過(guò)報(bào)道，含有國(guó)際先進(jìn)性和獨(dú)創(chuàng)性。（有報(bào)道兩者的體現(xiàn)量與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，但是兩者直接互相作用未見(jiàn)報(bào)道。）2.本課題新發(fā)現(xiàn)Pyk2磷酸化E-cadherin影響肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對(duì)于E-cadherin在肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制有新的理解，因此含有獨(dú)創(chuàng)性和先進(jìn)性。（五）年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究成果1.年度研究計(jì)劃.01-.12磷酸化實(shí)驗(yàn)擬定兩者的調(diào)節(jié)關(guān)系，肝癌組織內(nèi)源免疫共沉淀擬定互相作用可靠，同時(shí)擬定兩者結(jié)合的構(gòu)造域，磷酸化位點(diǎn)。蔗糖密度梯度超速離心，熒光共定位等有關(guān)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確證兩者共定位。同時(shí)收集病例標(biāo)本，收集臨床資料。純化蛋白制備抗體。.01-.12細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，裸鼠成瘤腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Pyk2的體現(xiàn)與E-cadherin的磷酸化狀態(tài)，以及細(xì)胞遷移的關(guān)系，擬定其調(diào)節(jié)機(jī)制。同時(shí)完畢E-cadherin/Pyk2的體現(xiàn)以及磷酸化狀態(tài)與肝癌的分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后、復(fù)發(fā)等臨床指標(biāo)的有關(guān)性分析。.01-.12補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)遺漏，整頓實(shí)驗(yàn)資料，統(tǒng)計(jì)解決實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文。2.預(yù)期研究成果1)擬定Pyk2能夠磷酸化E-cadherin，以及兩者互相作用的構(gòu)造域以及磷酸化位點(diǎn)。2)擬定Pyk2通過(guò)磷酸化E-cadherin，從而影響肝癌細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移。3)擬定在肝癌組織中E-cadherin蛋白水平、磷酸化狀態(tài)和Pyk2體現(xiàn)量的有關(guān)性，以及兩者的體現(xiàn)與肝癌轉(zhuǎn)移的有關(guān)性。4)在國(guó)外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表SCI論文2-4篇，其中影響因子不不大于5的有一篇以上。在國(guó)內(nèi)核心期刊發(fā)表論文2-4篇，并在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)會(huì)議交流。5)培養(yǎng)碩士2-3名。二、研究基礎(chǔ)與工作條件（一）研究基礎(chǔ)第一步：為了研究肝癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，首先選用E-cadherin（胞內(nèi)段，下列實(shí)驗(yàn)同）為誘餌在肝臟的cDNA文庫(kù)中做酵母雙雜交，尋找與E-cadherin互相作用的蛋白。我們先選用的是LACZ系統(tǒng)藍(lán)白斑篩選，但是由于背景高而放棄。后來(lái)選用CytoTRAP系統(tǒng)，背景明顯減低，測(cè)序后故意義的基因有31個(gè)。其中有4個(gè)為Pyk2片段。通過(guò)克隆Pyk2基因全長(zhǎng)驗(yàn)證，擬定兩者在酵母中的互相作用是強(qiáng)陽(yáng)性的（圖1）。（同時(shí)驗(yàn)證Pyk2的同源蛋白FAK與E-cadherin互相作用為可疑弱陽(yáng)性）。圖1酵母雙雜交（CytoTRAP系統(tǒng)）驗(yàn)證Pyk2與E-cadherin互相作用pMyr-Lamin為陰性對(duì)照，pMyr-SB為陽(yáng)性對(duì)照，E-Cad為E-Cadherin縮寫(xiě)，下列圖示與此相似。Psos-E-Cad為誘餌蛋白。CytoTRAP系統(tǒng)酵母雙雜交特點(diǎn)為兩個(gè)蛋白如果不互相作用在25℃時(shí)能夠生長(zhǎng)，而在37℃則不能生長(zhǎng),如陰性對(duì)照pMyr-Lamin所示。兩個(gè)蛋白如果互相作用則在兩個(gè)溫度下都能生長(zhǎng),如陽(yáng)性對(duì)照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2與陽(yáng)性對(duì)攝影似。第二步：原核體現(xiàn)E-cadherin和His-Pyk2進(jìn)行GST-Pulldown。為了驗(yàn)證兩者是直接結(jié)合，我們分別細(xì)菌中體現(xiàn)純化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全長(zhǎng)非常難純化，得不到純化的蛋白。我們體現(xiàn)純化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)成果證明Pyk2的激酶部分能夠與E-cadherin直接結(jié)合（圖2）。泳道123圖2原核體現(xiàn)E-cadherin和His-Pyk2激酶部分進(jìn)行GST-Pulldown。分別原核體現(xiàn)GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分別與相似量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育，重復(fù)洗三次，用his抗體Western檢測(cè)，成果顯示His-Pyk2激酶部分能夠與GST-E-cadherin結(jié)合（泳道3），而不能與GST結(jié)合（泳道2），泳道1上圖是純化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作為檢測(cè)原則。第三步：原核體現(xiàn)E-cadherin和細(xì)胞體現(xiàn)Myc-Pyk2進(jìn)行GST-Pulldown。我們轉(zhuǎn)染Myc-Pyk2于SYF細(xì)胞（SYF細(xì)胞株是酪氨酸激酶c-Src,Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成