代謝途徑總結(jié)

一、我國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展面臨的重要問題我國是生物制造大國我國不是生物制造強(qiáng)國工業(yè)生產(chǎn)菌種的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)體系尚未建立具體問題：工業(yè)生產(chǎn)菌種的技術(shù)水平較差產(chǎn)品濃度低，造成能耗高、廢水排放量大具體問題：發(fā)酵工藝落后二、代謝途徑工程的研究內(nèi)容1工業(yè)微生物基因組測序與功效基因組分析2微生物基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)與模型量化分析3工業(yè)微生物基因組的理性設(shè)計4基因組多位點(diǎn)快速進(jìn)化5基因組規(guī)模的全局?jǐn)_動6基因組刪減優(yōu)化(最小基因組)7人工合成基因組8大規(guī)模生化反映的胞外重構(gòu)三、代謝途徑工程的發(fā)展歷史代謝工程的最早實例(1974)1974年，Chakrabarty在假單孢菌P.putide和P.aeruginosa中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，增加了兩者對樟腦和萘的降解催化活性。這是代謝工程的第一種應(yīng)用實例，標(biāo)志著代謝工程作為一門學(xué)科的誕生。代謝工程作為一種專門學(xué)科的出現(xiàn)(1991)早期代謝工程最為成功的實例(1992)代謝工程發(fā)展-19961996年在美國召開了第一屆代謝工程大會，美國Mendes專家和Kel專家在大會上做了題為“代謝工程——讓細(xì)胞為人類工作”的報告，進(jìn)一步確立了代謝工程的地位與研究方向。反向代謝工程——1996先用誘變等手段變化某個表型，再根據(jù)造成這個表型變化的基因，進(jìn)一步強(qiáng)化目的表型。是當(dāng)代基于系統(tǒng)生物學(xué)的代謝途徑工程思想的來源。代謝工程發(fā)展-1998代謝工程發(fā)展-1999進(jìn)化代謝工程——運(yùn)用適應(yīng)性進(jìn)化(AdaptiveEvolution)有效提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)速率、產(chǎn)率和終濃度的技術(shù)。系統(tǒng)代謝工程——傳統(tǒng)代謝工程只是對局部的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析以及對局部的代謝途徑進(jìn)行改造。由于沒有從全局的角度去分析改造細(xì)胞,因此含有很大的局限性。高通量組學(xué)分析技術(shù)和基因組水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)能夠從系統(tǒng)水平上分析細(xì)胞的代謝功效。將這些系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)代謝工程以及下游發(fā)酵工藝優(yōu)化互相結(jié)合,進(jìn)一步提出系統(tǒng)代謝工程的概念。合成生物學(xué)——合成生物學(xué)是以工程學(xué)理論為根據(jù)，設(shè)計和合成新的生物元件,或是設(shè)計改造已經(jīng)存在的生物系統(tǒng)。這些設(shè)計和合成的核心元件(如酶、基因電路、代謝途徑等)含有特定的操作原則；小分子生物元件能夠組裝成大的整合系統(tǒng),從而解決多個特殊問題。四、代謝途徑工程技術(shù)近期發(fā)展趨勢傳統(tǒng)代謝工程技術(shù)日趨成熟大量傳統(tǒng)工業(yè)微生物的代謝工程升級：傳統(tǒng)工業(yè)微生物向少數(shù)工業(yè)微生物的聚集：非微生物合成的產(chǎn)物改由微生物生產(chǎn)改造的復(fù)雜性和設(shè)計的精確性：復(fù)雜代謝工程已成為重要的技術(shù)發(fā)展趨勢系統(tǒng)生物學(xué)飛速發(fā)展增進(jìn)生物體設(shè)計改造日漸成熟合成生物學(xué)的發(fā)展增進(jìn)生物模塊的原則化對DNA操作能力的進(jìn)化：量變-質(zhì)變1.系統(tǒng)生物學(xué)與工業(yè)生物技術(shù)組學(xué)技術(shù)(X-omics)超快基因組測序技術(shù)基于基因芯片的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析基于二維電泳和MALDI-TOF的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)基于色譜分離和質(zhì)譜鑒定技術(shù)的代謝物組學(xué)基于同位素技術(shù)的代謝通量組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)與工業(yè)生物技術(shù)2.合成生物學(xué)與工業(yè)生物技術(shù)End代謝途徑工程(MetabolicPathwayEngineering)第二章細(xì)胞代謝的生物化學(xué)基礎(chǔ)本章重要內(nèi)容一.工業(yè)生物技術(shù)中亟待解決的技術(shù)問題二.微生物合成特定產(chǎn)物的生物化學(xué)基礎(chǔ)三.微生物的初級代謝四.微生物的次級代謝(略)五.非微生物來源天然產(chǎn)物的合成代謝一.工業(yè)生物技術(shù)中亟待解決的技術(shù)問題1目的產(chǎn)物產(chǎn)量的進(jìn)一步提高——高產(chǎn)量2副產(chǎn)物含量的減少/消除——高轉(zhuǎn)化率3盡量短的時間內(nèi)完畢發(fā)酵過程——高生產(chǎn)強(qiáng)度4異源蛋白的高效合成與理性修飾5合成微生物原來不能合成的物質(zhì)5合成微生物原來不來合成的物質(zhì)6擴(kuò)展底物運(yùn)用范疇非常規(guī)底物的耐受性問題高分子量底物的分解(蛋白質(zhì)、多糖、脂類)底物的修飾——磷酸化過程吸取過程所需轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降解所需要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白降解中間產(chǎn)物的耐受性問題高效降解所需的額外能量供應(yīng)非常規(guī)底物降解的輔因子/氧化還原平衡問題7對極端環(huán)境的耐受性——更酸/更堿對于有機(jī)酸而言，更低的最適發(fā)酵pH值，意味著更少的中和劑的添加和產(chǎn)物分離過程中更少的強(qiáng)酸的消耗；對于堿性條件下穩(wěn)定的產(chǎn)物(多個pKa偏堿性的蛋白，生物堿等)而言，更堿的pH值意味著更穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)量。8對極端環(huán)境的耐受性——更高/更低溫度更高的發(fā)酵溫度意味著更少的冷卻水消耗；更低的貯藏溫度耐受性，意味著更長的貯藏周期(乳酸菌、芽孢桿菌等活菌制劑)。9對極端環(huán)境的耐受性——高濃度有機(jī)溶劑高濃度有機(jī)溶劑能夠破壞細(xì)胞膜組分，從而造成細(xì)胞的死亡。對高濃度有機(jī)溶劑的耐受，能夠明顯提高微生物積累丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑的效率和最后產(chǎn)量。二.微生物合成特定產(chǎn)物的生物化學(xué)基礎(chǔ)1.細(xì)胞組分細(xì)胞生長的表征辦法測定總細(xì)胞體積測定細(xì)胞數(shù)(OD)測定細(xì)胞干重測定細(xì)胞濕重測定細(xì)胞有機(jī)物干重2.大分子底物的降解3.底物/產(chǎn)物的運(yùn)輸過程細(xì)胞膜的功效——1.選擇性透過作用轉(zhuǎn)運(yùn)方式(1)離子通道介導(dǎo)的被動運(yùn)輸過程(2)載體介導(dǎo)的氫離子共轉(zhuǎn)運(yùn)(3)載體-受體介導(dǎo)的氫離子共轉(zhuǎn)運(yùn)(4)基本的主動運(yùn)輸(底物吸取)(5)基團(tuán)轉(zhuǎn)位能量耦合系統(tǒng)濃度梯度質(zhì)子電動勢ATP結(jié)合盒(ATPBindingCassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白光吸取驅(qū)動底物水平磷酸化細(xì)胞膜的功效——2.離子穩(wěn)定作用細(xì)胞膜的功效——3.代謝過程支撐作用細(xì)胞膜的功效——4.微生物互相作用過程識別細(xì)胞膜的功效——5.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的第一環(huán)節(jié)三.微生物的初級代謝基本概念微生物在生長發(fā)育和繁殖過程中，需要不停地從外界環(huán)境中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)通過一系列的生化反映，轉(zhuǎn)變成能量和構(gòu)成細(xì)胞的物質(zhì)，并排出不需要的產(chǎn)物。這一系列的生化過程稱為新陳代謝。微生物的代謝(metabolism)是指發(fā)生在微生物細(xì)胞中的分解代謝(catabolism)與合成代謝(anabolism)的總和。新陳代謝涉及分解代謝和合成代謝初級代謝和次級代謝物質(zhì)代謝和能量代謝（能量代謝涉及產(chǎn)能代謝和耗能代謝）基本概念合成代謝（Anabolism)：指細(xì)胞（酶）運(yùn)用簡樸的小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子的過程，這個過程要消耗能量。合成代謝所運(yùn)用的小分子物質(zhì)，來源于分解代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物或環(huán)境中的小分子營養(yǎng)物質(zhì)。分解代謝（catabolism）：指細(xì)胞（酶）將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)，并在這個過程中產(chǎn)生能量。分為三個階段將蛋白質(zhì)、多糖及脂類等大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解成氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(zhì)將第一階段產(chǎn)物勁一步分解成為更簡樸的乙酰輔酶A、丙酮酸以及能進(jìn)入三羧酸循環(huán)的某些中間產(chǎn)物，產(chǎn)生某些ATP、NADH及FADH2通過三羧酸循環(huán)將第二階段產(chǎn)物完全降解成CO2,并產(chǎn)生ATP、NADH及FADH2第二和第三階段產(chǎn)生的通過電子傳遞鏈被氧化，產(chǎn)生大量的ATP分解代謝和合成代謝關(guān)系分解代謝為合成代謝提供能量和原料；合成代謝是分解代謝的基礎(chǔ)在代謝過程中，微生物通過分解作用產(chǎn)生化學(xué)能，光合微生物還可將光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能，這些能量用于：1.合成代謝；2.微生物的運(yùn)動和運(yùn)輸；3.熱和光。無論是分解代謝還是合成代謝，代謝途徑都是由一系列持續(xù)的酶反映構(gòu)成的，前一部反映的產(chǎn)物是后續(xù)反映的底物。細(xì)胞能有效調(diào)節(jié)有關(guān)的酶促反映，使生命活動得以正常進(jìn)行。某些微生物在代謝過程中，除產(chǎn)生其生命活動所必需的初級代謝產(chǎn)物和能量外，還會產(chǎn)生某些次級代謝產(chǎn)物。這些物質(zhì)除有助于微生物生存，還與人類生產(chǎn)生活親密有關(guān)?；靖拍畛跫壌x：(primarymetabolite)普通指含有明確的生理功效，對維持生命活動不可缺少的物質(zhì)代謝過程。次級代謝：(secondarymetabolite)指沒有明確生理功效，似乎并不是維持生命活動所必需的物質(zhì)代謝過程。微生物代謝的特點(diǎn)由于微生物“比表面積”巨大，因而代謝速率極快；由于種類繁多，因而代謝類型（途徑）極其多樣；代謝的嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和靈活性1.微生物分類微生物分類按DNA及核糖體RNA原核生物古細(xì)菌真核生物按能量來源光能營養(yǎng)型(光合作用)化能營養(yǎng)型(化學(xué)反映)微生物分類按運(yùn)用的碳源自養(yǎng)型微生物異養(yǎng)性微生物按運(yùn)用氧的能力嚴(yán)格好氧菌兼性好氧菌耐氧厭氧菌嚴(yán)格厭氧菌2.物質(zhì)代謝概述代謝代謝(metabolism)是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的多個化學(xué)反映的總稱，它重要由分解代謝(catabolism)和合成代謝(anabolism)兩個過程構(gòu)成。分解代謝：將大分子物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)的過程合成代謝：將簡樸的小分子物質(zhì)合成復(fù)雜大分子的過程分解代謝的作用提供前體化合物提供細(xì)胞代謝活動所需的能量生長：細(xì)胞構(gòu)造物質(zhì)合成產(chǎn)物合成維持：物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動、亞細(xì)胞構(gòu)造形成、大分子周轉(zhuǎn)等提供還原力NADHNADPH合成代謝由前體化合物合成大分子單體由前體化合物合成產(chǎn)物由單體形成大分子化合物蛋白核酸多糖脂肪分解代謝的三個階段第一階段：將蛋白質(zhì)、多糖及脂類等大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解成為氨基酸、單糖及脂肪酸等小分子物質(zhì)；第二階段：將第一階段產(chǎn)物進(jìn)一步降解成更為簡樸的乙酰輔酶A、丙酮酸以及能進(jìn)入三羧酸循環(huán)的某些中間產(chǎn)物，在這個階段會產(chǎn)生某些ATP、NADH及FADH2；第三階段：通過三羧酸循環(huán)將第二階段產(chǎn)物完全降解生成CO2，并產(chǎn)生ATP、NADH及FADH2。第二和第三階段產(chǎn)生的ATP、NADH及FADH2通過電子傳遞鏈被氧化，可產(chǎn)生大量的ATP?；墚愌跷⑸锏纳镅趸彤a(chǎn)能形式：與氧結(jié)合，脫氫，失去電子過程：脫氫（電子），遞氫，受氫功效：產(chǎn)能(ATP)，產(chǎn)還原力([H])，產(chǎn)小分子中間代謝物類型：發(fā)酵，有氧呼吸，無氧呼吸3.中心代謝途徑EMP途徑受到嚴(yán)格的調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控(操縱子、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的克制)反饋克制酶別構(gòu)克制胞內(nèi)輔因子水平(ADP/ATP、NAD/NADH)碳代謝物阻遏效應(yīng)氮源有關(guān)的調(diào)控饑餓狀態(tài)的恢復(fù)狀況其它限制性底物的供應(yīng)HMP途徑即單磷酸己糖途徑(HexoseMonophosphatePathway)，也稱戊糖磷酸途徑(PentosePhosphatePathway)。分為氧化階段和非氧化階段功效：提供還原力(NADPH)提供前體化合物核糖磷酸(涉及5-磷酸核糖-1-焦磷酸,PRPP)磷酸赤蘚糖HMP途徑Glucose6-phosphate+2NADP++H2O→ribulose5-phosphate+2NADPH+2H++CO2ED途徑ED途徑(Entner-Douderoffpathway)，亦稱為KDPG途徑(2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconatepathway)ED途徑是HMP途徑的6-P-GA處的分支途徑，它有兩個特殊的酶，6-P-GA脫水酶和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸醛縮酶(KDPG醛縮酶)，因此ED途徑又叫KDPG途徑。在大多數(shù)假單胞菌中，ED途徑可能是葡萄糖降解的重要代謝途徑。發(fā)酵運(yùn)動單胞菌是現(xiàn)在所知的唯一能在厭氧條件下使用ED途徑的微生物。PK途徑(PhosphoketolasePathway)PK途徑也是從單磷酸己糖6-P-GA開始降解的，經(jīng)歷HMP途徑氧化部分的反映，生成Xu-5-P后，被特有的酶裂解為3C化合物(GA-3-P)和2C化合物(乙酰磷酸，高能磷酸化合物)。這個特有的酶叫做磷酸酮解酶(phosphoketolase),由于有這個酶而把這條單磷酸己糖途徑命名為磷酸酮解酶途徑，簡稱PK途徑。HPK途徑(Hexosephosphoketolase)PK途徑不同于以上已介紹的可兼用于需氧和厭氧條件下降解的途徑，微生物在厭氧條件下借助PK途徑不僅能夠運(yùn)用葡萄糖，并且能夠運(yùn)用D-核糖，D-木糖和L-阿拉伯糖。這3種糖首先各自轉(zhuǎn)化成Xu-5-P，然后經(jīng)PK途徑降解成PYR和Ac-P(高能磷酸化合物乙酰磷酸)。葡萄糖經(jīng)PK途徑降解成PYR時所生成的ATP的量只有經(jīng)EMP途徑的二分之一。在雙歧桿菌和木醋桿菌中發(fā)現(xiàn)了另一條磷酸酮解酶途徑，在這條途徑中磷酸酮解酶以單磷酸己糖F-6-P為底物，將F-6-P裂解為4-磷酸赤蘚糖(E-4-P)和Ac-P，因此這個磷酸酮解酶事實上是磷酸己糖酮解酶(hexosephosphoketolase)。因這個酶而把這條磷酸酮解酶途徑命名為磷酸己糖酮解酶途徑，簡稱為HPK途徑。HPK途徑的意義如果一種微生物沒有二磷酸果糖醛縮酶(EMP途徑)，沒有6-磷酸葡萄糖脫氫酶(HMP途徑、ED途徑、PK途徑)，那么這種微生物就不能用以上途徑來降解葡萄糖；若要在厭氧條件下降解葡萄糖，則需用HPK途徑。如果這種微生物中還存在HMP途徑非氧化階段的轉(zhuǎn)酮-轉(zhuǎn)醛酶系統(tǒng)的話，那么這條途徑的中間產(chǎn)物F-6-P和E-4-P逆向運(yùn)行可生成多個磷酸戊糖(涉及C5P、C5’P和C5”P)。葡萄糖直接氧化途徑以上四種途徑(EMP、HMP、ED、PK/HPK途徑)的第一步均是在已糖激酶的催化下首先把葡萄糖激活成G-6-P，然后，才開始降解；而有些微生物如假單胞菌屬和氣桿菌屬的某些種的細(xì)菌沒有已糖激酶，只得用變通的方法：首先把葡萄糖直接氧化成葡萄糖酸，后者在葡萄糖酸激酶的催化下，把葡萄糖激活成生成6-P-GA，形成葡萄糖直接氧化途徑。葡萄糖直接氧化途徑在有分子氧存在的狀況下運(yùn)行。葡萄糖直接氧化途徑曲霉和青霉的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的氧化脫氫反映，這個酶是以FAD為輔基的黃素蛋白。葡萄糖脫氫生成葡萄糖酸內(nèi)酯(GL)，同時FAD被還原成FADH2，后者直接(不通過電子傳遞鏈)被分子氧再生；同時生成H2O2，然后H2O2被觸酶分解。這樣的黃素蛋白水平的呼吸并不能為細(xì)胞提供代謝能。5.能量代謝發(fā)酵VS.發(fā)酵代謝類型：發(fā)酵指微生物細(xì)胞將有機(jī)物氧化釋放的電子直接交給底物本身未完全氧化的某種中間產(chǎn)物，同時釋放能量并產(chǎn)生多個不同的代謝產(chǎn)物。有機(jī)物部分氧化，釋放出一小部分能量。1.發(fā)酵途徑發(fā)酵的種類有諸多，可發(fā)酵的底物有糖類、有機(jī)酸、氨基酸等，其中以微生物發(fā)酵葡萄糖最為重要。生物體內(nèi)葡萄糖被降解成丙酮酸的過程稱為糖酵解，重要分為四種：EMP途徑、HMP途徑、ED途徑、PK途徑。2.發(fā)酵類型在糖酵解過程中生成的丙酮酸可被進(jìn)一步代謝。在無氧條件下，不同的微生物分解丙酮酸后會積累不同的代謝產(chǎn)物。根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物不同，發(fā)酵的類型重要有乙醇發(fā)酵、乳酸發(fā)酵、丙酮丁醇發(fā)酵、混合酸發(fā)酵等。呼吸呼吸是微生物中最普遍和最重要的生物氧化方式和重要的產(chǎn)能方式。呼吸是指微生物在降解底物的過程中，將釋放出的電子交給NAD(P)＋、FAD或FMN等電子載體，再經(jīng)電子傳遞系統(tǒng)傳給外源電子受體，從而生成水或其它還原型產(chǎn)物并釋放出較多能量的過程。其中，以分子氧作為最后電子受體的呼吸稱為有氧呼吸，以氧以外的其它氧化型化合物作為最后電子受體的呼吸稱為無氧呼吸。呼吸與發(fā)酵的根本區(qū)別在于：電子載體不是將電子直接傳遞給底物降解的中間產(chǎn)物，而是交給電子傳遞系統(tǒng)，逐步釋放出能量后再交給最后電子受體。1)有氧呼吸(Respiration)最普遍、最重要的生物氧化或產(chǎn)能方式除糖酵解過程外，還涉及三羧酸循環(huán)和電子傳遞鏈兩部分反映。在發(fā)酵過程中，葡萄糖通過糖酵解作用形成的丙酮酸在厭氧條件下轉(zhuǎn)變成不同的發(fā)酵產(chǎn)物，而在有氧呼吸過程中，丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCA）被徹底氧化成水和CO2，同時釋放出大量能量。產(chǎn)能量多，一分子葡萄糖凈產(chǎn)38個ATP。有氧呼吸底物脫下的氫通過完整的呼吸鏈(電子傳遞鏈，ElectronTransferChain－ETC)傳遞,最后被外源分子氧接受，產(chǎn)生水并釋放出ATP形式的能量電子傳遞系統(tǒng)ATP的生成胞內(nèi)電子載體電子載體的種類黃素蛋白泛醌硫鐵蛋白細(xì)胞色素NAD(P)(H)線粒體中電子載體的作用方式電子傳遞系統(tǒng)是一系列氫和電子傳遞體構(gòu)成的多酶氧化還原體系電子傳遞系統(tǒng)的功效電子供體接受電子并將電子傳遞給電子受體通過合成ATP保存電子傳遞過程中釋放的部分能量真核生物線粒體內(nèi)膜上的呼吸鏈四.微生物的次級代謝(略)五.非微生物來源天然產(chǎn)物的合成代謝1.萜類化合物萜類由甲戊二羥酸（mevalonicacid,MVA）衍生、且分子式符合(C5H8)n通式化合物及其衍生物均稱為萜類化合物。特點(diǎn)：骨架龐雜、種類繁多、數(shù)量巨大、構(gòu)造千變?nèi)f化、生物活性廣泛。化學(xué)構(gòu)造特點(diǎn)：大多含有異戊二烯構(gòu)造片斷，其骨架以5個碳為基本單位。分類與分布萜類的生物合成首先由乙酰CoA與乙酰乙酰CoA生成甲戊二羥酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutarylCoA,HMG-CoA)，后者還原生成甲戊二羥酸(MVA)。MVA經(jīng)數(shù)步反映轉(zhuǎn)化成焦磷酸異戊烯酯(△3-isopentenylpyrophosphate,IPP)，IPP經(jīng)硫氫酶(sulphyhydryl酶)及焦磷酸異戊酯異構(gòu)酶(IPPisomerase)轉(zhuǎn)化為焦磷酸r,r－二甲基烯丙酯(r,r-dimethyl烯丙基pyrophosphate，DAPP)。IPP和DAPP稱“活性異戊二烯”，是萜類成分在生物體形成的真正前體，在生物合成中起著烷基化的作用。IPP和DAPP兩者均可轉(zhuǎn)化為半萜，并在酶的作用下，頭—尾相接縮合為焦磷酸香葉酯(geranylpyrophosphate,GPP)，衍生為單萜類化合物，或繼續(xù)與IPP分子縮合衍生為其它萜類物質(zhì)。2.黃酮類化合物黃酮類化合物黃酮是一類重要的天然色素，也是中藥中一類重要的有效成分。分布廣泛，多分布于高等植物中，集中在被子植物。以唇形科、玄參科、爵麻科、菊科等存在較多。常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在。在花、葉、果中多為苷；在木質(zhì)部多為苷元，生理活性多個多樣，作用強(qiáng)，毒性不大。以前，黃酮類化合物(flavonoids)重要是指基本母核為2-苯基色原酮(2-phenyl-chromone)類化合物，現(xiàn)在則是泛指兩個苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳鏈互相聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。黃酮類化合物的生物合成途徑生物合成研究表明A環(huán)來自于三個丙二酰輔酶A，B環(huán)來自于桂皮酰輔酶A。3.生物堿類化合物化學(xué)構(gòu)造分類一、有機(jī)胺類生物堿氮原子不結(jié)合在環(huán)狀構(gòu)造內(nèi)，這類生物堿數(shù)目不多二、氮雜環(huán)類生物堿氮原子結(jié)合在環(huán)狀構(gòu)造內(nèi)。其中大多為五元、六元氮雜環(huán)衍生物五元氮雜環(huán)類生物堿：基本構(gòu)造為吡咯和四氫吡咯六元氮雜環(huán)類生物堿：基本構(gòu)造為吡啶和六氫吡啶（哌啶）。這類生物堿衍生物數(shù)量較多其它構(gòu)造類型生物堿4.苯丙素類天然產(chǎn)物End代謝途徑工程(MetabolicPathwayEngineering)第三章代謝途徑的調(diào)控機(jī)制本章重要內(nèi)容一.原核生物基因體現(xiàn)的調(diào)控方略二.真核生物基因體現(xiàn)的調(diào)控方略三.酶水平的調(diào)控四.全局調(diào)控方略五.調(diào)控過程的優(yōu)化方略六.代謝途徑調(diào)控辦法——基因工程方略一.原核生物基因體現(xiàn)調(diào)控目錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控第二節(jié)操縱子的其它調(diào)控形式第三節(jié)轉(zhuǎn)錄的終止調(diào)控第四節(jié)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始第五節(jié)DNA重排對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控第六節(jié)翻譯的調(diào)控第一節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控RNA聚合酶結(jié)合在啟動子上一.操縱子模型1.調(diào)節(jié)基因和構(gòu)造基因的基本概念操作子(operon)：原核細(xì)胞中由操縱區(qū)同一種和幾個構(gòu)造基因聯(lián)合起來協(xié)同活動的整體順式作用元件(cis-actingelement)：位于基因旁側(cè)序列中能影響基因體現(xiàn)的序列反式作用因子(trans-actingfactor)：能直接或者間接地識別或結(jié)合在順式作用云間核心序列上參加調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)?構(gòu)造基因(structuralgenes)：決定某一種蛋白質(zhì)或RNA分子結(jié)構(gòu)的一段DNA調(diào)節(jié)基因(regulatorgenes):調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的基因一.操縱子模型2.正調(diào)控和負(fù)調(diào)控?正調(diào)控：阻遏蛋白從操縱基因上脫離后，激活蛋白與啟動子結(jié)合以及和RNA聚合酶的互相作用，協(xié)助構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄起始，增進(jìn)對應(yīng)蛋白的合成?負(fù)調(diào)控：阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合，制止了RNA聚合酶對操縱子構(gòu)造基因的轉(zhuǎn)錄?誘導(dǎo)物：有阻遏作用的代謝產(chǎn)物二.乳糖操縱子1.調(diào)控位點(diǎn)操作子(operator)CAP或cAMP受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)啟動子(promoter)二.乳糖操縱子2.在乳糖操縱子上阻遏物結(jié)合區(qū)的RNA聚合酶結(jié)合區(qū)的重疊3.誘導(dǎo)物的加入和去除去對LacmRNA的影響二.乳糖操縱子4.誘導(dǎo)物和阻遏物成為調(diào)節(jié)操縱子的開關(guān)(左圖)5.當(dāng)無誘導(dǎo)物時阻遏物結(jié)合在操作基因上(右圖)二.乳糖操縱子6.阻遏蛋白和誘導(dǎo)物的互相作用操作基因發(fā)生構(gòu)成性突變，操縱子構(gòu)成性體現(xiàn)(左圖)LacI發(fā)生突變，操縱子構(gòu)成性體現(xiàn)(右圖)二.乳糖操縱子LacI基因構(gòu)成性隱形誘變劑(左圖)非誘導(dǎo)性Lacs誘變子的優(yōu)勢(右圖)二.乳糖操縱子7.阻遏蛋白和操縱基因的結(jié)合與解離阻遏蛋白的單體構(gòu)造操縱位點(diǎn)的回文序列二.乳糖操縱子阻遏作用發(fā)生位點(diǎn)CAP結(jié)合位點(diǎn)CAP結(jié)合位點(diǎn)的保守序列(左圖)CAP蛋白可結(jié)合相對于啟動子的不同位點(diǎn)(右圖)二.乳糖操縱子CAP作用方式二.乳糖操縱子1.誘導(dǎo)物的結(jié)合解離模型(左圖)2.誘導(dǎo)物和阻遏蛋白結(jié)合的模型(右圖)葡萄糖和半乳糖對lac啟動子的聯(lián)合作用第二節(jié)操縱子的其它調(diào)控形式第三節(jié)轉(zhuǎn)錄的終止調(diào)控終止調(diào)控概念前導(dǎo)序列(leadersequence)：位于翻譯起始密碼子AUG之前的一段不參加翻譯的mRNA5’端的核苷酸片段衰減子(attenuator)：位于細(xì)菌操縱子上游的一段核苷酸序列衰減作用(attenuation)：原核生物中通過翻譯前導(dǎo)肽而實現(xiàn)控制DNA的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控方式。trp操縱子的構(gòu)造基因和控制區(qū)第四節(jié)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始一.亞基的替代因子factor定義?作為全部RNA聚合酶的輔助因子，識別啟動子共有序列且與全酶結(jié)合的一種非專一性蛋白。因子factor使用范疇(1)不同類型啟動子的隨著因子；(2)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始一.亞基的替代3.因子的更換用于噬菌體時序調(diào)節(jié)左圖4.s因子替代用于孢子形成過程中(右圖)二.RNA聚合酶的代換RNA聚合酶定義以一條DNA鏈或RNA為模板催化由核苷5’-三磷酸合成RNA的酶RNA聚合酶代換T7噬菌體的轉(zhuǎn)錄時序調(diào)控方式第五節(jié)DNA重排對轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控第六節(jié)原核生物的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控1．稀有密碼子對翻譯的影響2.重疊基因?qū)Ψg的影響3.RNA高級構(gòu)造對翻譯的影響4.魔斑核苷酸水平對翻譯的影響第六節(jié)翻譯的調(diào)控一.翻譯起始的調(diào)控二.翻譯水平的自我調(diào)控二.翻譯水平的自我調(diào)控二.翻譯水平的自我調(diào)控三.二級構(gòu)造對翻譯起始的調(diào)控四.反義RNA的調(diào)控五.翻譯的延伸調(diào)控1.稀有密碼子的調(diào)控rpsU操縱子中3個基產(chǎn)物的拷貝數(shù)五.翻譯的延伸調(diào)控2.二級構(gòu)造對翻譯延伸的調(diào)控六.翻譯的終止調(diào)控1.嚴(yán)緊反映(strigentresponse)?定義：當(dāng)細(xì)菌在缺少合成蛋白質(zhì)所必須的氨基酸時，停止合成核糖體RNA的反映功效：1)克制rRNA基因的啟動子，2)克制多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的延伸七.mRNA穩(wěn)定性對翻譯的調(diào)控麥芽糖操縱子中的反向重復(fù)序列和mRNA穩(wěn)定性mRNA穩(wěn)定性的重要調(diào)控方式mRNA本身的序列元件mRNA結(jié)合蛋白mRNA的翻譯產(chǎn)物核酸酶、病毒等因素三.酶水平的調(diào)控酶活性的調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)：指在酶分子水平上的一種代謝調(diào)節(jié)，它是通過變化現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率。酶活性的克制、激活，是微生物代謝中存在的兩種矛盾的過程。酶活性的激活系指在分解代謝途徑中，背面的反映可被較前面的中間產(chǎn)物所增進(jìn)。酶活性的克制重要是反饋克制，它重要體現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物（即終產(chǎn)物）過量時，這個產(chǎn)物可反過來直接克制該途徑中第一種酶的活性，促使整個反映過程減慢或停止，從而避免了末端產(chǎn)物的過多累積。（一）酶活性的激活常見的酶活性的激活是前體激活，多發(fā)生在分支代謝途徑，即代謝途徑中的背面的反映可被較前面的一種代謝中間產(chǎn)物所增進(jìn)。如：粗糙脈胞酶的異檸檬酸脫氫酶的活性受到檸檬酸的激活。（二）酶活性的克制酶活性的克制涉及：競爭性克制反饋克制反饋克制：指反映途徑中某些中間產(chǎn)物或末端產(chǎn)物對該途徑中前面反映的影響。但凡反映加速地稱為正反饋；但凡反映減速的稱為負(fù)反饋。末端產(chǎn)物的反饋克制普遍存在于合成途徑中。反饋克制：直鏈?zhǔn)椒种Тx途徑：兩種以上的末端產(chǎn)物反饋克制的類型1．直線式代謝途徑中的反饋克制2．分支代謝途徑中的反饋克制。反饋克制的狀況較為復(fù)雜。為避免在一種分支上的產(chǎn)物過多時不致同時影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物已發(fā)展出多個調(diào)節(jié)方式。(1)同功酶調(diào)節(jié)同功酶是指能催化相似的生化反映，但酶蛋白分子構(gòu)造有差別的一類酶，它們雖同存于一種個體或同一組織中，但在生理、免疫和理化特性上卻存在著差別。同功酶的重要功效在于其代謝調(diào)節(jié)。在一種分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一種較早的反映是由幾個同功酶所催化時，則分支代謝的幾個最后產(chǎn)物往往分別對這幾個同功酶發(fā)生克制作用。如：大腸桿菌天冬氨族氨基酸合成途徑中，有三個同工酶天冬氨酸激酶ⅠⅡⅢ分別受賴氨酸、蘇氨酸、硫氨酸反饋調(diào)節(jié)(2)協(xié)同反饋克制指分支代謝途徑中的幾個末端產(chǎn)物同時過量時才干克制共同途徑中的第一種酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。如：谷氨酸棒桿菌合整天冬氨族氨基酸時，天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋克制。(3)累積反饋克制催化分支合成途徑第一步反映的酶有幾個末端產(chǎn)物克制物，但每一種如過量，按一定百分率單獨(dú)克制共同途徑中的第一種酶活性，總的克制效果是累加的，各末端產(chǎn)物所起的克制作用互不影響，只影響這個酶促反映的速率。兩種末端產(chǎn)物同時存在時，能夠起著比一種末端產(chǎn)物大得多的反饋克制作用。(4)增效反饋克制代謝途徑中任何一種末端產(chǎn)物過量時，僅部分克制共同途徑中的第一種酶活性，但兩個末端產(chǎn)物同時過量時，其克制作用可超出各產(chǎn)物存在的克制能力的總和。如6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸合成途徑。(5)次序反饋克制每個分支末端產(chǎn)物克制分支后的第一種酶，產(chǎn)生部分克制作用。通過逐步有次序的方式達(dá)成的調(diào)節(jié)。如枯草芽孢桿菌的芳香族氨基酸合成途徑和球型紅假單胞菌的蘇氨酸合成途徑。當(dāng)E過多時，可克制C→D，這時由于C的濃度過大而促使反映向F、G方向進(jìn)行，成果又造成了另一末端產(chǎn)物G濃度的增高。由于G過多就克制了C→F，成果造成C的濃度進(jìn)一步增高。C過多又對A→B間的酶發(fā)生克制，從而達(dá)成了反饋克制的效果。這種通過逐步有次序的方式達(dá)成的調(diào)節(jié)，稱為次序反饋克制。四.全局調(diào)控方略1.能荷的調(diào)控2.微生物的信號傳導(dǎo)——雙組分調(diào)控系統(tǒng)雙組分調(diào)控系統(tǒng)在生物中普遍存在雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)菌、古細(xì)菌、單細(xì)胞真核生物、高等植物中都有發(fā)現(xiàn)雙組分系統(tǒng)調(diào)控種類繁多的響應(yīng)過程營養(yǎng)獲得：氮、磷、碳能量代謝：電子傳遞系統(tǒng)、吸取和分解代謝過程毒力因子(virulence)：質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、降解性分泌、毒毒分泌、粘附因子(adherencefactors)環(huán)境中物理、化學(xué)因素的適應(yīng)：pH、滲入壓、光量復(fù)雜的發(fā)育途徑(developmentalpathways)：產(chǎn)孢、子實體發(fā)育、菌絲體分化雙組分調(diào)控系統(tǒng)雙組分調(diào)控系統(tǒng)是一種運(yùn)用磷?；蜣D(zhuǎn)移控制基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，由兩個要素構(gòu)成：感受激酶(或組氨酸激酶)(Sensorkinases，histidinekinase)，普通包含兩個域：輸入域(感受域)：監(jiān)測環(huán)境的刺激。針對不同的環(huán)境刺激因子，含有高度的多樣性。傳導(dǎo)域：感受刺激后自動磷酸化。含有高度的序列保守性，含有一種不變的組氨酸殘基，能夠被一種依賴于ATP的方式磷酸化；一種含有保守氨基酸的短的可伸縮區(qū)域，普通是兩個富甘氨酸模體，與ATP結(jié)合有關(guān)(NG1FG2motif).響應(yīng)調(diào)控子(Responseregulator)：含有一種氨基端的保守接受區(qū)域，其中一種高度保守的天冬氨酸殘基能夠被感受激酶磷酸化，最后造成羧端輸出域的激活。2.碳代謝物阻遏效應(yīng)3.氮代謝物阻遏效應(yīng)4.滲入壓脅迫的響應(yīng)機(jī)制5.好氧/厭氧代謝過程的轉(zhuǎn)換6.氧脅迫(Oxidativestress)7.pH脅迫和酸耐受8.熱脅迫和熱激反映(Heatshockresponse)五.代謝調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)方略1.典型的分子生物學(xué)方略(1)生物化學(xué)研究辦法——1.酶學(xué)辦法(1)生物化學(xué)研究辦法——2.同位素標(biāo)記法(2)分子生物學(xué)研究辦法——1.分子印跡雜交技術(shù)(2)分子生物學(xué)研究辦法——2.隨機(jī)突變技術(shù)(2)分子生物學(xué)研究辦法——3.酵母雙雜交(2)分子生物學(xué)研究辦法——4.免疫熒光辦法(3)系統(tǒng)生物學(xué)研究辦法七.調(diào)控過程的優(yōu)化方略1.簡樸代謝途徑改造方略設(shè)計方略：正向(Constructive)代謝工程正向代謝工程：重新分派中心途徑代謝流變化代謝途徑變化代謝途徑是指變化分支代謝途徑的流向，阻斷其它代謝產(chǎn)物的合成，以達(dá)成提高目的產(chǎn)物的目的。變化代謝途徑有多個辦法，如加速限速反映、變化分支代謝途徑流向、構(gòu)建代謝旁路、變化能量代謝途徑等不同辦法消除原有代謝途徑引入新的代謝途徑加速限速反映最成功的一種例子是頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建，頭孢霉素C的合成途徑。青霉素N是頭孢霉素合成的中間體。當(dāng)用頂頭孢發(fā)酵時，發(fā)現(xiàn)了青霉素N的積累，這表明下一步酶反映是頭孢霉素合成代謝中的限速環(huán)節(jié)。因此克隆了編碼脫乙酰氧基頭孢霉素C合成酶基因cefEF，并導(dǎo)入頂頭孢中，所得轉(zhuǎn)化子的頭孢霉素C產(chǎn)量提高了25％，而青霉素N的積累量減少至原來的1/16。頭孢霉素C的代謝工程菌的構(gòu)建變化分支代謝途徑流向是指提高代謝分支點(diǎn)的某一代謝途徑酶系的活性，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，亦可提高目的末端代謝產(chǎn)物的的產(chǎn)量。如：賴氨酸合成，選育解除反饋克制和缺失高絲氨酸脫氫酶的突變株，提高了賴氨酸的產(chǎn)量。而為了獲得蘇氨酸的高產(chǎn)菌株，以解除了反饋克制的賴氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌為宿主，轉(zhuǎn)入高絲氨酸脫氫酶基因，成果使原來不產(chǎn)生蘇氨酸的賴氨酸產(chǎn)生菌的賴氨酸產(chǎn)量由65g/L下降至4g/L，而蘇氨酸產(chǎn)量增加到52g/L，使賴氨酸產(chǎn)生菌轉(zhuǎn)變成蘇氨酸產(chǎn)生菌。人工控制黃色短桿菌的代謝過程生產(chǎn)賴氨酸2.反向代謝途徑工程設(shè)計方略：反向(Inverse)代謝工程反向代謝工程：基因組測序發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)3.進(jìn)化(Evolutionary)代謝工程進(jìn)化(Evolutionary)代謝工程泰樂菌素菌種改良自然適應(yīng)和進(jìn)化代謝工程4.計算機(jī)輔助的代謝途徑改造方略六.代謝途徑調(diào)控辦法——基因工程方略1.大腸桿菌基因工程操作2.釀酒酵母基因工程操作3.整合體現(xiàn)與基因敲除4.可重復(fù)運(yùn)用的基因工程操作體系5.酶分子的改造——定點(diǎn)突變與定向進(jìn)化酶分子的改造理性設(shè)計(rationaldesign)與非理性設(shè)計(irrationaldesign)目的：變化酶的反映動力學(xué)特性、對溫度/pH的敏感性、弱化反饋克制等改造方略：酶的化學(xué)修飾定點(diǎn)突變易錯PCR(errorpronePCR)DNAshuffling雙功效酶(1)酶的化學(xué)修飾對酶分子上的某些基團(tuán)進(jìn)行修飾，以改善酶的性質(zhì)可溶性大分子修飾用對特定氨基酸殘基作用的修飾劑與酶反映，以擬定酶的活性中心Ser——PMSFLys——PLPTrp——NBSHis——DEPCArg——PGOGlu/Asp——CCMT(2)定點(diǎn)突變基于PCR的一步法基因突變基于PCR的一步法基因突變(3)易錯PCR(errorpronePCR)變化PCR的條件，使發(fā)生一定的堿基隨機(jī)錯配而引發(fā)多點(diǎn)突變變化dNTP的比例低保真度DNA聚合酶增加離子濃度枯草桿菌蛋白酶：3點(diǎn)突變體活力提高38倍，10點(diǎn)突變體活力提高256倍(4)DNAshuffling(5)雙功效酶6.基于RNA的代謝途徑調(diào)控7.適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)微生物生存的環(huán)境面臨多個脅迫在發(fā)酵過程中微生物面臨著多個脅迫的影響。多個微生物由于其產(chǎn)物不同或生存條件的不同，所面臨的脅迫類型多個各樣。如產(chǎn)有機(jī)酸類面臨著酸脅迫的影響，產(chǎn)酒精類面臨著高濃度乙醇脅迫等。適應(yīng)性進(jìn)化提高微生物耐脅迫能力，將增強(qiáng)微生物對環(huán)境的抵抗力，如提高對酸脅迫，鹽脅迫，氧化脅迫，高濃度底物克制能力等。對于微生物工業(yè)化過程中達(dá)成高產(chǎn)量，高產(chǎn)率，高生產(chǎn)強(qiáng)度的目的含有進(jìn)一步增進(jìn)作用。篩選菌株耐脅迫能力的慣用辦法重要為菌種誘變和Genomeshuffling。而適應(yīng)性進(jìn)化(Adaptiveevolution)是近年來研究較多的用于改良菌株使其獲得特定生理生化性質(zhì)的一種辦法。適應(yīng)性進(jìn)化適應(yīng)性進(jìn)化技術(shù)(Adaptiveevolution)是近年來研究較多的用于改良菌株使其獲得特定生理生化性質(zhì)的一種辦法，普遍認(rèn)為其能夠在短期內(nèi)快速變化菌株的某些重要生理特性而維持其它的某些優(yōu)良改善不發(fā)生變化。對于增強(qiáng)某種脅迫的適應(yīng)能力來說，重要是在恒化培養(yǎng)系統(tǒng)中漸進(jìn)性的增強(qiáng)這種脅迫的強(qiáng)度，隨著時間的推移，菌種本身通過突變變化細(xì)胞內(nèi)代謝和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)（如蛋白質(zhì)，細(xì)胞膜，信號分子的變化等），甚至是基因組來適應(yīng)這種外界條件的激烈變化。而未突變的菌株由于在惡劣環(huán)境條件下不能正常生長。從而能夠得到含有一定耐脅迫能力特性的菌株。設(shè)計思路搖瓶進(jìn)化設(shè)計思路發(fā)酵罐進(jìn)化思路設(shè)計應(yīng)注意的某些問題1. 初始脅迫強(qiáng)度擬定；原則，不能生長太好也不能太差。如進(jìn)化耐酸能力的菌株，首先考察了pH在5.0,4.5,4.3,4.0條件下的生長曲線（最適為5.5）.2. 轉(zhuǎn)接時間控制（搖瓶進(jìn)化）：需在對數(shù)生長中期轉(zhuǎn)接，且每進(jìn)化2周需重新測生長曲線；3. 稀釋率D擬定（罐上進(jìn)化）：隨著時間增加，菌株對脅迫能力增強(qiáng)，需重新擬定稀釋率D,建議每兩到三周一次；4. 每轉(zhuǎn)接幾代或每隔一周定時保藏甘油管，避免染菌；5. 脅迫強(qiáng)度的遞進(jìn)式增加，需根據(jù)生長曲線來判斷。適應(yīng)性進(jìn)化菌株耐脅迫能力機(jī)制的研究與應(yīng)用熒光定量PCR及其有關(guān)技術(shù)為擬定代謝流的變化提供了必要技術(shù)手段；基因芯片的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和二維電泳及質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組技術(shù)，為認(rèn)識與微生物耐脅迫機(jī)制方面的抗性基因提供了必要的技術(shù)手段；通過組學(xué)技術(shù)研究與脅迫有關(guān)的抗性基因后，可將抗性基因在原菌株中過量體現(xiàn)來增強(qiáng)菌株對脅迫的抗性，進(jìn)行基于反向代謝工程技術(shù)的改造方略。代謝途徑工程(MetabolicPathwayEngineering)第四章胞內(nèi)生化反映的模型化與分析本章重要內(nèi)容一.代謝網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其性質(zhì)二.代謝途徑合成三.代謝通量分析四.代謝控制分析五.代謝網(wǎng)絡(luò)分析的網(wǎng)絡(luò)資源和輔助軟件六.代謝網(wǎng)絡(luò)模型研究熱點(diǎn)問題一.代謝網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其性質(zhì)1.代謝網(wǎng)絡(luò)的基本性質(zhì)(1)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的表達(dá)辦法(圖論的理解)(2)網(wǎng)絡(luò)及其組件的性質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)代謝網(wǎng)絡(luò)：分解代謝途徑、合成代謝途徑和膜輸送體系的有序組合。代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成：(1)中心代謝途徑(2)收斂途徑：指向中心代謝途徑，并以中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑(3)發(fā)散途徑：以中心代謝途徑的中間化合物為起點(diǎn)，從中心代謝途徑發(fā)散的途徑在一定范疇內(nèi)可對代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行人為的修飾，從而實當(dāng)代謝途徑(網(wǎng)絡(luò))的延伸和剪接。網(wǎng)絡(luò)剛性微生物經(jīng)初級代謝途徑提供細(xì)胞生長和維持所必需的前體和能量。作為自然界長久進(jìn)化的成果，微生物細(xì)胞含有在代謝網(wǎng)絡(luò)某些分支處對抗碳架物質(zhì)流量變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，使這種流量分布不會因某終端產(chǎn)物對其合成途徑的反饋調(diào)節(jié)的解除而發(fā)生重大的調(diào)節(jié)。生物體這種固有的對流量變化的抵抗能力稱為代謝或網(wǎng)絡(luò)的剛性。載流途徑與節(jié)點(diǎn)載流途徑：代謝網(wǎng)絡(luò)中一部分首尾相連形成的一條從原料化合物到目的產(chǎn)物的途徑。涉及原料化合物(碳架物質(zhì))胞外降解和進(jìn)入細(xì)胞、碳架物質(zhì)經(jīng)胞內(nèi)進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)化進(jìn)入中心代謝途徑、中心代謝途徑的一部分、目的產(chǎn)物合成途徑、目的產(chǎn)物排出細(xì)胞等五部分。節(jié)點(diǎn)：載流途徑兩個或多個反映的交匯或分流處。碳架物質(zhì)流量在這里可發(fā)生變化，從而影響目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。重要節(jié)點(diǎn)在產(chǎn)物形成時碳架物資流量分派發(fā)生明顯變化的節(jié)點(diǎn)。重要節(jié)點(diǎn)在一定條件下可發(fā)生變化節(jié)點(diǎn)的剛性節(jié)點(diǎn)的剛性：節(jié)點(diǎn)下游分支對于代謝變化的抗性。節(jié)點(diǎn)的分類：柔性節(jié)點(diǎn)弱剛性節(jié)點(diǎn)剛性節(jié)點(diǎn)柔性節(jié)點(diǎn)(Flexiblenode)下游分支的流量容易變化的節(jié)點(diǎn)。導(dǎo)向每一分支的酶對節(jié)點(diǎn)代謝物的親和性相近似，每個分支的反映速度也相近。每一分支的流量受對應(yīng)的終端產(chǎn)物反饋克制控制。許多氨基酸的合成途徑中的節(jié)點(diǎn)屬于這類，解除反饋克制可提高產(chǎn)量。弱剛性節(jié)點(diǎn)(Weaklyrigidnode)節(jié)點(diǎn)的流量分派由它的一種分支的動力學(xué)占優(yōu)勢。分支動力學(xué)指的是用于構(gòu)成分支的全部酶歸并在一起的響應(yīng)。優(yōu)勢(dominant)分支酶的高活性和高親和性，缺少反饋克制。即使附屬(subordinate)分支(流向產(chǎn)物的分支)解除反饋克制，還是有相稱大的流量進(jìn)入優(yōu)勢分支。這類節(jié)點(diǎn)是用突變選擇技術(shù)育種的典型，許多用誘變提高產(chǎn)量的例子屬于這類。剛性節(jié)點(diǎn)(Rigidnode)節(jié)點(diǎn)的一種或多個分支的分派率被嚴(yán)密控制。這種控制普通通過反饋克制和一種代謝物對另一種分支的酶的交叉激活兩種作用的結(jié)合來實現(xiàn)。剛性節(jié)點(diǎn)見于許多變構(gòu)酶，其流量分派不易變化。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的基本類型網(wǎng)絡(luò)與亞網(wǎng)絡(luò)（能夠把載流途徑的活躍局部看作是亞網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)造能夠抽象為兩個基本類型：獨(dú)立型和依賴型。依賴型(independent)網(wǎng)絡(luò)：網(wǎng)絡(luò)(或亞網(wǎng)絡(luò))中的每個節(jié)點(diǎn)向終產(chǎn)物提供一種按化學(xué)計量消耗的構(gòu)成部分。全部分支中的流量必須達(dá)成化學(xué)計量平衡，以避免胞內(nèi)成分的累積和分泌。構(gòu)成此網(wǎng)絡(luò)的各重要節(jié)點(diǎn)處的流量分派必須協(xié)調(diào)，全部重要節(jié)點(diǎn)同樣重要。獨(dú)立型(dependent)網(wǎng)絡(luò)：從重要節(jié)點(diǎn)形成的代謝產(chǎn)物不凝聚。只要變化在單一節(jié)點(diǎn)上的流量分派就有可能提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。代謝網(wǎng)絡(luò)分析代謝流分析(metabolicfluxanalysis，MFA)：定量分析通過代謝網(wǎng)絡(luò)各分支的碳流，不需反映動力學(xué)信息代謝控制分析(metaboliccontrolanalysis，MCA)：定量分析控制通過代謝網(wǎng)絡(luò)各分支的碳流的酶，需要反映動力學(xué)信息代謝流分析擬定節(jié)點(diǎn)剛性擬定未知途徑計算未測定流量計算最大理論產(chǎn)率代謝流分析舉例二.代謝途徑合成三.代謝通量分析代謝平衡分析Step1:定義系