響應(yīng)面法優(yōu)化連錢草總黃酮提取工藝

響應(yīng)面法優(yōu)化連錢草總黃酮提取工藝

連草是屬于嘴唇科的血毒癥[glechomalanituba（nakai）kubar.]干燥的土壤部分。連錢草性味涼辛,微苦,微寒。歸肝、腎、膀胱經(jīng),具有利膽、利尿、抗菌、抗炎、降血糖、抗腫瘤以及抗腹瀉等藥理作用,主治黃疸型肝炎、膽囊炎、膽石癥、疳積、腎結(jié)石、膀胱結(jié)石、多發(fā)性膿瘍、瘡癰腫痛、嬰兒濕疹、跌打損傷、腮腺炎、牙痛等癥。連錢草的主要化學(xué)成分有萜類、黃酮、揮發(fā)油、有機酸以及多糖等。其中,萜類化合物主要包括熊果酸、齊墩果酸、烏蘇酸、2-羥基烏蘇酸等;黃酮和黃酮苷類化合物包括木犀草素、蘆丁、芹菜素、刺槐素、海常素、胡蘿卜苷、槲皮素、連錢草酮等;揮發(fā)油類化合物包括左旋薄荷酮、胡薄荷酮、旅烯、檸檬烯、1,8-桉葉素、異薄荷酮、異松樟酮、α-松油醇等,具有特殊的清香味;有機酸類化合物包括阿魏酸、咖啡酸、介子酸、月桂酸、迷迭香酸、原兒茶醛、迷迭香酸甲酯、三十烷酸、肉豆蔻酸等有機酸。目前針對連錢草總黃酮提取工藝的研究尚不多見。本研究通過考察提取時間、提取溫度、液固比和乙醇等因素,采用單因素試驗和Box-Behnken試驗優(yōu)化了連錢草總黃酮的提取工藝,結(jié)果理想,報告如下。1儀器和試劑盒1.1主要儀器和設(shè)備TU-1810型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、RT-02A型多功能粉碎機(弘荃機械企業(yè)有限公司)、BECKMANCOUCTER型離心機(美國BECKMAN公司)、HHS型恒溫水浴鍋等儀器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。1.2植物活檢丹glechomalus連錢草由南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供(經(jīng)姜寧副教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹[Glechomalongituba(Nakai)Kupr.]),烘干,粉碎,過60目篩;無水乙醇、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁等均為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。2方法和結(jié)果2.1黃酮含量測定2.2bohsk試驗2.2.1c.11d回歸模型在預(yù)試驗基礎(chǔ)上,采用Design-Expert8.0的Box-Behnken設(shè)計,以提取時間、溫度、液固比、乙醇濃度為自變量,黃酮提取率為響應(yīng)值。試驗因素水平設(shè)計和結(jié)果分別見表1、表2。根據(jù)試驗結(jié)果,建立了如下回歸模型:R=6.38–0.16A+0.057B+0.44C+0.11D+0.15AB+0.11AC+0.62AD+0.36BC+0.030BD+0.013CD-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。該回歸模型的決定系數(shù)R2為0.9746,校正后的決定系數(shù)(adj-R2)為0.9493,說明該模型擬合性較好。對回歸模型和各因子進行方差分析,結(jié)果見表3。從表3可知:該模型F值為38.41,P值<0.0001,而失擬性試驗F值為2.19,不顯著,說明此模型與實際情況擬合得較好。根據(jù)F值和P值,可以得出各因素對響應(yīng)值的作用由大到小為:C2>A2>B2>C>D2>AD>BC>A>D>AB>AC>B>BD>CD。其中:B、AB、AC、BD、CD對響應(yīng)值的作用不顯著,所以上述回歸方程中以上幾項可以忽略,所得回歸方程如下:R=6.38–0.16A+0.44C+0.11D+0.62AD+0.36BC-0.63A2–0.61B2–0.85C2–0.54D2。2.2.2黃酮提取率的確定由Box-Behnken試驗結(jié)果所得的回歸方程,可以計算出當A=-0.05,B=0.13,C=0.28,D=0.08時,R有極大值6.45%。將各因素的水平回代,可以得到最優(yōu)工藝是提取時間1.4975h,41.3℃,液固比22.8∶1,乙醇濃度90.4%時,黃酮提取率最高。為了操作方便,將優(yōu)化的工藝確定為提取時間1.5h,提取溫度41℃,液固比23∶1,乙醇濃度90%,并對該工藝進行了驗證,連錢草黃酮提取率在6.32%~6.47%之間。說明經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝具有很強的實踐指導(dǎo)作用。2.2.3不同a和c和d對黃酮提取率的影響圖1為響應(yīng)面分析。從中可以看出:當C=0.28,D=0.08時,黃酮的提取率隨著A和B的增加而上升,當達到最大值后,A和B的上升反而會使提取率下降(圖1A);B和D分別為0.13、0.08時,A和C處于低水平時,響應(yīng)值較低,隨著A和C的升高,響應(yīng)值也隨之升高,當?shù)揭欢ǔ潭群?響應(yīng)值不再隨A和C的上升而上升,而是下降(圖1B);如B=0.13、C=0.28,A和D的變化會顯著影響黃酮的提取率,當A和D較小時,黃酮提取率也較低,當A和D增大后,提取率也增高,當提取率達到極大值后,其會隨著A和D的上升而下降(圖1C);圖1D顯示了B和C對響應(yīng)值的影響,響應(yīng)值開始隨著B和C的上升而上升,當達到一定值后,反而會隨著B和C的上升而下降;隨著B和D的變化,響應(yīng)值的變化則較平緩(圖1E);A=-0.05、B=0.13時,當C和D較小時,提取率也較低,C和D上升后,提取率也增加,當提取率達到最大值后,C和D的增加反而會使提取率下降,不過下降的幅度較上升的幅度平緩(圖1F)。3提取過程中黃酮與植物的相互作用提取時間、提取溫度、液固比和乙醇濃度是影響黃酮提取率的四個主要因素。提取時間的延長會增加植物體內(nèi)的黃酮溶出,當提取達到一定時間后,連錢草黃酮的提取率不再顯著增加,這是因為浸出液中黃酮與植物內(nèi)的黃酮濃度差縮小,黃酮溶出速度下降。提取溫度41℃時連錢草黃酮的提取率最高,隨后溫度的提高反而會使提取率下降,說明高溫可能會破壞連錢草黃酮的結(jié)構(gòu)。液固比的增加會提高植物內(nèi)黃酮與浸出液中黃酮的濃度差,從而加快黃酮的溶出,但當液固比過大時,會使后續(xù)處理繁瑣,加大處理過程中的損耗從而