南方紅豆杉紫杉醇的生產(chǎn)

南方紅豆杉紫杉醇的生產(chǎn)

子松醇是一種含有糊精素的復(fù)合氨基酸。它是從蘑菇科蘑菇植物的樹皮和針葉等相關(guān)組織中提取的生代產(chǎn)物。它是世界著名的光譜和活性物質(zhì)。它能夠促進微管蛋白的合成,而微管蛋白可以和微管蛋白質(zhì)相結(jié)合形成穩(wěn)定的維管,從而阻止維管的解聚,“凍結(jié)”有絲分裂過程中的紡錘體,讓腫瘤細胞停留在G2期和M期中間,抑制腫瘤細胞的復(fù)制,進而阻止癌細胞的增殖,逐漸縮小腫瘤的體積,而不是直接把癌細胞殺死。它是現(xiàn)階段唯一可以控制癌細胞生長的植物藥物。迄今為止,紫杉醇及其類似物只發(fā)現(xiàn)于裸子植物紅豆杉科紅豆杉屬及澳洲紅豆杉屬植物中。紅豆杉屬植物廣泛分布于全球,大概有11種,我國有4個種和1個變種。南方紅豆杉Taxuschinensisvar.mairei別名為美麗紅豆杉,是紅豆杉科紅豆杉屬植物,是中國紅豆杉的一個變種,特產(chǎn)于我國,且廣泛分布于我國南方各省區(qū)。由于該物種在自然界中罕見,且其自然繁殖能力很低,現(xiàn)已處于瀕危狀態(tài),故被我國列為一級保護植物。它不僅具有重要的藥用與遺產(chǎn)價值,還具有較高的觀賞和材用價值。南方紅豆杉是我國紅豆杉屬植物中紫杉醇含量較高的一種,其枝葉、莖皮、根、種子、果肉等組織中均含有紫杉醇,其根皮中紫杉醇的含量最高,達到0.0178%。但是,南方紅豆杉的生長極其緩慢,原料供應(yīng)極其匱乏,且其紫杉醇含量較低,故組織與細胞培養(yǎng)就成為原料生產(chǎn)的重要途徑之一。為了解決紫杉醇供不應(yīng)求的問題,前人在細胞懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行了大量的試驗,以期建立一個高產(chǎn)紫杉醇的懸浮體系。然而,組織與細胞培養(yǎng)的首要條件是獲得愈傷組織,高產(chǎn)紫杉醇的關(guān)鍵是建立優(yōu)良的細胞懸浮體系。因此,文中就通過南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)、細胞懸浮培養(yǎng)而生產(chǎn)紫杉醇的研究現(xiàn)狀與研究進展進行了綜述,分析了南方紅豆杉組織與細胞培養(yǎng)研究中存在的問題,以期為促進南方紅豆杉的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)、資源保護和發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)與技術(shù)指導(dǎo)。1細胞懸浮與愈傷組織分離誘導(dǎo)出符合要求的愈傷組織是組織培養(yǎng)和細胞懸浮培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。組織培養(yǎng)要求愈傷組織具有較高的分化能力,以便于后續(xù)的分化和再分化;而細胞懸浮培養(yǎng)則要求它結(jié)構(gòu)較松散,以利于懸浮培養(yǎng)。前人已經(jīng)做了大量的有關(guān)愈傷組織誘導(dǎo)的試驗,大多數(shù)試驗者都得到了愈傷組織,但在愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)過程中卻普遍出現(xiàn)了褐化且難以分化的現(xiàn)象。愈傷組織的誘導(dǎo)主要受外植體、基本培養(yǎng)基和激素等因素的影響。1.1南方紅豆外植體的誘導(dǎo)率袁夢如等人用南方紅豆杉的幼芽、幼莖和幼葉作為外植體,比較分析了不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的效率,同時對愈傷組織增殖的條件和懸浮細胞培養(yǎng)的條件進行了探索,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在相同的培養(yǎng)基上,幼芽、幼莖和幼葉的誘導(dǎo)率(分別為90%、85%、20%)各不相同,這證明了幼莖的誘導(dǎo)率高于幼葉這一結(jié)論。這一試驗結(jié)果也表明,幼芽、幼莖和幼葉誘導(dǎo)愈傷組織的效率從大到小依次為:幼芽>幼莖>幼葉。Fott-Neto等人選取東北紅豆杉的種皮、種子、幼莖和針葉作為外植體,研究了它們誘導(dǎo)愈傷組織的能力,結(jié)果表明幼莖是最佳的外植體;陳惠等人以采摘于山西陵川野生南方紅豆杉上的幼嫩莖段、老莖段、針葉切段為外植體,將它們培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn),幼莖產(chǎn)生愈傷組織的時間最早,且其誘導(dǎo)率最高,這和Fott-Neto等人的研究結(jié)果是一致的。張芳芳等人選用了3種類型的南方紅豆杉外植體:(1)去除了外種皮的成熟種子,在無菌濾紙上將胚剝離;(2)莖段,切成0.5~1.5cm長的小段;(3)側(cè)芽,先剝?nèi)ド贁?shù)外鱗,再用剪刀稍稍減碎。他們將上述外植體接種到添加了2,4-D的MS培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn),種胚的誘導(dǎo)率較高且愈傷組織的污染率較低。Lee等人認為,紅豆杉的胚是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體;而趙冬等人卻認為,嫩莖比針葉更適合作為外植體。他們在實驗中發(fā)現(xiàn),南方紅豆杉的嫩莖比較容易產(chǎn)生高質(zhì)量的愈傷組織:首先是莖的兩端膨大變白,葉柄的切口處產(chǎn)生愈傷組織,接著整個莖膨大,最后整個外植體可以全部轉(zhuǎn)化成愈傷組織。這與前人的研究報道是一致的。李斌連等人以嫩莖、葉片、側(cè)芽、莖尖為外植體,研究了不同外植體對南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的影響情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同的外植體對愈傷組織的誘導(dǎo)在數(shù)量上差別不大,但側(cè)芽的污染率很低,由其誘導(dǎo)出的愈傷組織顏色較淺,而且出愈時間較早;嫩莖和葉片的污染率在85%左右,其誘導(dǎo)的愈傷組織顏色濃綠,繼代培養(yǎng)時容易發(fā)生褐變。由此看來,側(cè)芽是誘導(dǎo)南方紅豆杉愈傷組織的最佳外植體。王德強等人認為,莖、葉、根誘導(dǎo)愈傷組織的能力從大到小依次為:莖>葉>根。他們在實驗中發(fā)現(xiàn),外植體的大小對愈傷組織的形成影響顯著,帶有部分葉的莖段不能形成愈傷組織,而帶有根的莖段則可以誘導(dǎo)愈傷組織。綜上所述,在南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)過程中,經(jīng)常采用的外植體包括莖段、側(cè)芽、葉片、種胚和根這5種,它們誘導(dǎo)愈傷組織的能力由高到低依次為:種胚>側(cè)芽>莖段>葉片>根。1.2培養(yǎng)基對南方紅豆愈傷組織的誘導(dǎo)趙冬等人研究發(fā)現(xiàn),MS和B5都可以誘導(dǎo)嫩莖產(chǎn)生愈傷組織,但是,用相同的激素組合處理后,B5誘導(dǎo)愈傷組織的能力比MS高3~4倍,且B5培養(yǎng)基中的愈傷組織萌動較早。Lee等人在進行紅豆杉胚培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),以B5為基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果較好。王德強等人以幼葉和幼莖為外植體,對其在MS、B5、N6、SH這4種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的情況進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):它們在MS上產(chǎn)生愈傷組織最快,只需7d左右,但培養(yǎng)20~30d后愈傷組織會逐漸褐化;在B5上培養(yǎng)8~10d后開始出現(xiàn)愈傷組織,且其比在MS培養(yǎng)基上出現(xiàn)的要緊密些,培養(yǎng)20d后有少量的褐化,但褐化程度比在MS培養(yǎng)基上出現(xiàn)的低;而其在SH培養(yǎng)基上較難形成愈傷組織,培養(yǎng)60d后仍然沒有變化,也沒有發(fā)生褐化;N6培養(yǎng)基上的外植體在培養(yǎng)20d后形成了愈傷組織,且其結(jié)構(gòu)緊密,褐化少。不同種類的培養(yǎng)基,因其組分不同,故其對南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)效果也有所不同。常用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、B5、N6、SH、WPM這幾種,大部分文獻資料顯示,在黑暗條件下培養(yǎng)時,B5誘導(dǎo)愈傷組織的效果較好。在選擇基本培養(yǎng)基時,要從形成愈傷組織時間的快慢、產(chǎn)生的愈傷組織是否適合后續(xù)工作、愈傷組織是否容易褐化及紫杉醇含量的高低這4個方面來考慮。1.3培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)蘇應(yīng)娟等人在MS培養(yǎng)基上進行了南方紅豆杉芽愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)實驗,得到了芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基,即MS+2,4-D2.0mg/L+NAA0.5mg/L。他們在實驗中發(fā)現(xiàn),在添加了KT的組合中,芽不能產(chǎn)生愈傷組織,即使偶爾出現(xiàn)愈傷組織也很快褐化;莖段愈傷組織的產(chǎn)生也因為加入了KT而延遲,且誘導(dǎo)率也有所降低。陳惠等人在實驗中發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D4.0mg/L+KT1.0mg/L或B5+2,4-D3.0mg/L+KT0.1mg/L+Phe(苯丙氨酸)0.1mol/L,它們的誘導(dǎo)率均可達到100%。當2,4-D的質(zhì)量濃度適宜時,與在MS培養(yǎng)基上出現(xiàn)的愈傷組織相比,在B5培養(yǎng)基上出現(xiàn)的愈傷組織褐化輕而生長快。盛長忠等人的實驗結(jié)果表明:2,4-D比NAA更有利于愈傷組織的形成,在培養(yǎng)基中加入同等濃度的2,4-D和NAA,前者的誘導(dǎo)率在95%以上,明顯高于后者。他們在觀察愈傷組織中發(fā)現(xiàn),在含有2,4-D的培養(yǎng)基上,愈傷組織顏色較新鮮,且塊大、松軟,而在含有NAA的培養(yǎng)基上,愈傷組織塊小、褐色、較硬。他們在實驗中還發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)基中添加適當濃度的水解酪蛋白、苯丙氨酸和乙酸鈉,能有效促進南方紅豆杉愈傷組織的生長和紫杉醇的積累。榮俊冬等人在對南方紅豆杉愈傷組織的培養(yǎng)研究中觀察發(fā)現(xiàn):用2.0mg/L的2,4-D處理過的葉、莖,其愈傷組織的誘導(dǎo)率高于用1.0mg/L或0.5mg/L的2,4-D處理過的,在添加了2,4-D的培養(yǎng)基上,愈傷組織的誘導(dǎo)率遠遠高于沒有添加的,且添加的最適濃度是2.0mg/L。趙冬等人研究認為,在B5培養(yǎng)基中添加2.0mg/L的2,4-D和0.5mg/L的6-BA,是最適合誘導(dǎo)莖段愈傷組織的培養(yǎng)的,其誘導(dǎo)率達76.0%,且愈傷組織的質(zhì)量好、塊大、松散,適合后續(xù)的液體懸浮培養(yǎng)。他們在實驗中發(fā)現(xiàn)2,4-D比NAA更有利于愈傷組織的形成,這與盛長忠等人的研究結(jié)果是一致的。而且,愈傷組織的狀態(tài)也有較大的差異:在添加了2,4-D和6-BA的培養(yǎng)基上,愈傷組織體積較大且疏松,呈淺綠色;而在添加了NAA和6-BA的培養(yǎng)基上,愈傷組織的體積較小且致密,顏色較深。李斌連等人的試驗結(jié)果表明:南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是B5+2,4-D2.0mg/L+NAA1.0mg/L+IAA0.2mg/L。杜亞填等人研究發(fā)現(xiàn),在MS培養(yǎng)基上,當2,4-D/NAA高于0.4時,這一條件對南方紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)不利。在誘導(dǎo)南方紅豆杉愈傷組織時,使用的激素種類較多,常用的有2,4-D、NAA、KT、6-BA、IAA這幾種。單獨使用時,2,4-D的誘導(dǎo)效果優(yōu)于NAA;當2,4-D的濃度在0.1~5.0mg/L時,添加的濃度越高,越有利于愈傷組織的誘導(dǎo);混合使用時,要注意控制分裂素和生長素的比例,一般將2,4-D和6-BA或NAA混合起來使用。2基本培養(yǎng)基前人的大量實驗結(jié)果證明,南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)效果以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基的為最佳。有關(guān)細胞懸浮培養(yǎng)高產(chǎn)紫杉醇的研究涵蓋面廣,主要包括前體飼喂、添加抑制劑、添加誘導(dǎo)子、調(diào)整植物生長調(diào)節(jié)劑的比例和有機碳源的濃度、添加無機鹽和有機附加物及促進劑組合等方面。2.1前體化合物的影響前體飼喂既可以通過增加底物量來加快反應(yīng)速率和提高產(chǎn)量,還能通過反饋抑制其他的分支路徑來促進反應(yīng)的順利完成,從而有效地提高紫杉醇的產(chǎn)量。常見的前體有絲氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、苯甲酸等物質(zhì),有關(guān)研究結(jié)果表明,這些前體物質(zhì)在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中都能較好地促進紫杉醇的合成。吳兆亮等人研究了南方紅豆杉細胞雙液相培養(yǎng)中前體飼喂和混合糖源這種生產(chǎn)培養(yǎng)基糖源對細胞生長和紫杉醇合成的的影響情況,結(jié)果表明:前體飼喂(苯丙氨酸、苯甲酰胺和醋酸鈉)或混合糖(麥芽糖和蔗糖)作為生產(chǎn)培養(yǎng)基糖源,其對提高南方紅豆杉細胞雙液相培養(yǎng)的紫杉醇產(chǎn)量有顯著的促進作用,而且前體飼喂和混合糖源的協(xié)同作用對其雙液相培養(yǎng)中紫杉醇產(chǎn)量的提高也有進一步的促進作用。2.2單合成二在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)過程中可以添加一些如樟腦、松油醇、a-蒎烯等單萜合成抑制劑,這些抑制劑可在一定程度上阻止能量和物流過多地流向單萜3個旁路途徑,使更多的能量和物流集中到由單萜合成二萜的途徑中來,從而提高紫杉醇的產(chǎn)量;且三者協(xié)同作用的效果更好。2.3紫杉醇的誘導(dǎo)生物固定在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中經(jīng)常使用的誘導(dǎo)子主要有兩種:一種是非生物誘導(dǎo)子,包括化學協(xié)同物質(zhì)(茉莉酸甲酯、花生四烯酸、水楊酸、甲基茉莉酮酸等物質(zhì))和一些人工合成化合物(苯甲酸等化合物);另一種是生物誘導(dǎo)子,通常為經(jīng)過高壓滅活的細菌、真菌、酵母的細胞壁萃取物。在紅豆杉懸浮培養(yǎng)體系中添加適量的誘導(dǎo)子,可有效刺激植物防衛(wèi)系統(tǒng),從而促進紫杉醇的代謝,同時使誘導(dǎo)得到的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中。茉莉酸甲酯(MethylJasmOnate)是一種常見的極其重要的誘導(dǎo)子,廣泛存在于植物防御信號的傳遞途徑中,在細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中承擔著極其重要的任務(wù)。一些科學家認為,加入茉莉酸甲酯的初始時間及濃度對紫杉醇的生物合成有著重要的影響;他們研究發(fā)現(xiàn),想要進一步提高紫杉醇的產(chǎn)量,就要把茉莉酸甲酯和花生四烯酸結(jié)合起來作為一種誘導(dǎo)子,這比它們單獨作用的效果會更理想。水楊酸與硝酸銀的協(xié)同作用對紫杉醇產(chǎn)量的提高也有較顯著的影響,而水楊酸與花生四烯酸協(xié)同作用的效果卻比前者差。王艷東等人研究發(fā)現(xiàn),甲基茉莉酮酸不僅能促進細胞初生代謝提前向次生代謝轉(zhuǎn)化,并且能夠增強細胞的次生代謝,有利于細胞相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的合成。除此以外,在培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸或甲基茉莉酮酸或水楊酸,均可提高愈傷組織中紫杉醇的含量。藏新等人研究認為,低濃度的油菜素內(nèi)酯(BR)對于細胞生長具有輕微的促進作用;他們還認為,BR在最適宜的誘導(dǎo)濃度范圍內(nèi)對培養(yǎng)細胞沒有毒害作用。因其用量少,價格低廉,故可以考慮將其用于大規(guī)模的紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇這一領(lǐng)域之中。真菌誘導(dǎo)物大多數(shù)可以在一定程度上提高紫杉醇的含量,但其會強烈抑制紅豆杉的細胞生長。張長平等人和余龍江等人在懸浮培養(yǎng)南方紅豆杉細胞體系研究中發(fā)現(xiàn),當細胞進入指數(shù)生長末期時加入真菌誘導(dǎo)子,次生代謝產(chǎn)物中紫杉烷類的生物合成均得到了加強,其中紫杉醇的含量達到67mg/L,是對照組的5倍左右。2.4紫杉醇對細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的影響為了有效地提高紫杉醇的生物合成量,需要對生長素和分裂素的比例作適當?shù)恼{(diào)整。Fett-neto等人的研究結(jié)果表明,適宜的KT和2,4-D的比例能夠有效地促進細胞的生長和紫杉醇產(chǎn)量的提高。另外,甘煩遠等人在實驗中發(fā)現(xiàn),低濃度(0.5~1.0mg/L)的2,4-D更有利于紫杉醇的合成,而較高濃度(l.0~2.5mg/L)的2,4-D則對細胞的生長比較有利;使用NAA后紫杉醇產(chǎn)量的變化與使用2,4-D后的結(jié)果大致相同,但是,使用IAA比使用2,4-D更能提高次生代謝產(chǎn)物紫杉醇的產(chǎn)量。2.5蔗糖濃度對紫杉醇含量的影響Kim的研究結(jié)果表明:不論使用哪種糖分,其最適濃度都是6%;高產(chǎn)紫杉醇的最優(yōu)碳源是果糖,它對細胞的生長有較好的效果;甘露醇和山梨醇雖不能促進細胞的生長,卻能促使紫杉醇的大量合成。甘煩遠等人的實驗結(jié)果表明:當蔗糖濃度在20~30g/L的范圍內(nèi)時,紅豆杉細胞的長勢良好;但是,當蔗糖濃度達到40g/L時,紫杉醇的含量最高,同時對細胞的生長也有利;而向懸浮培養(yǎng)體系中加入葡萄糖卻會抑制紫杉醇的合成。晏瓊等人的實驗結(jié)果表明:在南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中補充添加果糖對細胞生長狀態(tài)和紫杉烷合成具有顯著作用,其會引起細胞的生理狀態(tài)發(fā)生改變,而且蛋白質(zhì)(代表酶的含量)的含量有明顯的提高,目的產(chǎn)物紫杉醇(Taxol)被大量合成,其產(chǎn)量在搖瓶和反應(yīng)器體系中最高分別達到81.0和71.7mg/L。2.6細胞內(nèi)的磷酸鹽平衡Ketchum等人對紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)中氮、磷等無機鹽的吸收狀況及其對細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的影響情況進行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在細胞生長初期(0~6d),培養(yǎng)液中的磷酸鹽就被迅速、大量地吸收了;到了中期(18d),幾乎變成零;但到后期,在培養(yǎng)液中仍然可以檢測到磷酸鹽。這個結(jié)果也說明了,后期細胞中的磷酸鹽已逐漸滲透到外面的培養(yǎng)液中。蘇應(yīng)娟等人在研究稀土和氮源對南方紅豆杉的細胞生長和紫杉醇產(chǎn)量的影響情況后發(fā)現(xiàn):當NH4+和NO3-的質(zhì)量濃度比等于1且培養(yǎng)液中總氮源的濃度達到27mmol/L時,細胞的生長速率和紫杉醇的產(chǎn)量都達到最大值。另外,甘煩遠等人在進行細胞懸浮培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn):向懸浮體系中添加適量的如水解乳蛋白(LH)、酪蛋白氨基酸(CA)或者椰子汁(CM)等有機添加劑,都能使紫杉醇的產(chǎn)量得到提高;而且CA和CM的添加對于提高細胞生長率也有促進作用。2.7檸檬酸三銨系對中國杉醇品質(zhì)的影響李干雄等人在進行中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn):蔗糖、檸檬酸三銨、硝酸銀、氨基酸前體和水楊酸組合對細胞的生長和紫杉醇的積累都有一定的影響,在懸浮培養(yǎng)之始加入1.67mg/L的硝酸銀,第9天加入10g/L的蔗糖,第9天添加1540mg/L檸檬酸三銨時,紫杉醇含量達到最高,經(jīng)過這個最優(yōu)組合的處理,紫杉醇的質(zhì)量濃度達到39.2mg/L,比最差組合(2.1mg/L)處理的提高了18.7倍。李干雄、李志良等人在進行中國紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn):氨基酸前體、水楊酸與硝酸銀和D-果糖的添加時間對懸浮培養(yǎng)的中國紅豆杉細胞的生長幾乎沒有什么影響,但能顯著促進次生代謝產(chǎn)物——紫杉醇的生物合成;在懸浮培養(yǎng)的第14天向培養(yǎng)液中加入1.67mg/L的硝酸銀,第18天加入0.1mg/L的水楊酸,第21天加入氨基酸前體,第21天再加入10g/L的D-果糖及2mg/L的硫酸鑭時,其對紫杉醇的促進作用最為理想,經(jīng)過這個最優(yōu)組合的處理后,紫杉醇的質(zhì)量濃度可以達到10.05mg/L,比經(jīng)最差組合處理后紫杉醇的含量(1.77mg/L)提高了5.7倍。3誘導(dǎo)愈傷組織的純化目前,關(guān)于南方紅豆杉愈傷組織誘導(dǎo)和細