蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)

蝴蝶蘭組培快繁技術(shù)

蝴蝶蘭是蘭花科多年生附生草本植物?；ǘ涿利?，結(jié)構(gòu)精細而獨特，顏色各異，花期長。它以“蘭皇木蘭”的聲譽而聞名，具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，市場需求量大。蝴蝶蘭為單莖性氣生蘭,植株極少發(fā)生側(cè)芽,常規(guī)的分株繁殖困難,而種子在自然環(huán)境中難以萌發(fā),無法滿足市場對蝴蝶蘭種苗的大量需求。長期以來,科研工作者不斷探索蝴蝶蘭優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖的方法,并取得了矚目的成績。組織培養(yǎng)已經(jīng)成為蝴蝶蘭種苗繁殖最好的方法,1949年RotorG成功報道利用花梗腋芽獲得試管苗到現(xiàn)在利用蝴蝶蘭種苗的根、莖、葉等進行批量生產(chǎn)獲得克隆種苗,滿足了市場對蝴蝶蘭種苗的需求。本文概述了近年來蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)的研究進展,以期為蝴蝶蘭的生產(chǎn)發(fā)展提供參考。1苗木移栽三階段蝴蝶蘭組培的過程一般分為外植體誘導、繼代增殖、壯苗、生根、健化移栽5個階段。目前,國內(nèi)外蝴蝶蘭組培研究主要集中在外植體選擇、基本培養(yǎng)基選擇、植物激素種類和配比濃度、組培環(huán)境等方面。1.1外生體關(guān)于蝴蝶蘭組培外植體選擇方面的報道較多,且各有優(yōu)缺點,主要常見外植體見表1。1.2通過培養(yǎng)基內(nèi)誘導蝴蝶蘭組培繁殖通常有無菌播種、類圓球莖(PLBs)、叢生芽三大途徑。蝴蝶蘭種子細小,自然條件下很少萌發(fā),而通過無菌播種,種胚可膨大為圓球莖,后繼續(xù)分化成實生苗,從而達到繁殖目的。按播種方式,無菌播種可分為裂莢播種和未裂莢播種兩類,裂莢播種不容易消毒,而未裂果莢要求有足夠的成熟度,多為授粉后發(fā)育4個月左右的果莢。蝴蝶蘭無菌播種常用花寶一號、Kyoto和MS培養(yǎng)基,形成的原球體及其后小苗發(fā)育可在同一種培養(yǎng)基中培養(yǎng);對于一些原生種的種子,在培養(yǎng)基中最好不添加活性炭及香蕉泥,否則原球體易白化或黃化死亡。雖然蝴蝶蘭種子量大且易得,但所獲得的后代植株性狀不一、變異性大,商業(yè)價值低,不宜大量生產(chǎn)。該方法較適用于不會產(chǎn)生分離的品種或原生種,或應(yīng)用于育種。類圓球莖是蘭科植物組織培養(yǎng)中產(chǎn)生的特有現(xiàn)象,可以通過花梗腋芽、幼葉、根尖、莖尖等部位直接誘導,也可以先誘導愈傷組織,再從愈傷組織誘導類圓球莖。據(jù)報道,誘導類圓球莖的材料來源廣泛,但不同外植體使用的培養(yǎng)基成分均不同。一般以葉片、莖尖誘導類圓球莖最易,根尖、根段最難。國內(nèi)王懷宇等提出的叢生芽途徑,是指通過誘導類圓球莖直接誘導叢生芽來穩(wěn)定遺傳母本特性,減少變異的方法,具有技術(shù)難度低、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點。一般采用花梗中上部位的飽滿腋芽作為外植體,誘導率高,每個腋芽可以誘導出1～3個芽。叢生芽途徑的開辟,加速了蝴蝶蘭組培苗工廠化生產(chǎn)的進程,成為目前蝴蝶蘭無性繁殖的主要途徑。在實際應(yīng)用中,應(yīng)根據(jù)自身條件和目的,選擇合適的外植體和誘導途徑。外植體雖多種多樣,但消毒處理的方法類似,常選用的消毒試劑有75%的酒精、0.1%升汞、1%次氯酸鈉溶液、雙氧水等,消毒時間也從數(shù)秒到20min不等。2培養(yǎng)基和激素2.1對三大苗木枝的誘導蝴蝶蘭組織培養(yǎng)所采用的基本培養(yǎng)基包括MS、B5、花寶、KC及其改良型等,其中MS基本培養(yǎng)基最為常用。楊美純等研究發(fā)現(xiàn),MS最適合蝴蝶蘭種子萌發(fā),王慧俞等則認為KC最適,曾宋君等研究認為花寶1號、花寶2號明顯優(yōu)于1/2MS、MS和KC等。魯雪華等在花梗節(jié)間切段誘導類原球莖的試驗中認為,1/2MS和改良MS比MS效果要好。廖福琴研究認為,對V31品種的幼嫩花梗誘導最佳基本培養(yǎng)基是MS。周俊輝等以紅花品種蝴蝶蘭為材料,對比MS、1/2MS和改良KC對類圓球莖的增殖效果,結(jié)果表明:改良KC效果最好,MS最差。可見,選擇最適培養(yǎng)基應(yīng)根據(jù)不同品種、不同外植體和培養(yǎng)階段對組分及其濃度加以修改,最好根據(jù)培養(yǎng)過程中原球莖或試管苗的生長情況及時調(diào)整。2.2激素配比對植物基人原球莖增殖的影響有研究表明,單獨使用生長素不能誘導出叢生芽,只有在生長素和細胞分裂素同時存在時,才能誘導出叢生芽,由此可見激素種類和濃度配比非常關(guān)鍵。蝴蝶蘭組培中6-BA濃度為0.1～10.0mg/L,NAA使用濃度為0.05～5.00mg/L。培養(yǎng)基類型及激素種類和濃度會因品種和培養(yǎng)階段的差異而各不相同。對于某一品種的誘導階段和增殖階段,所用基本培養(yǎng)基和激素配比可大致相同,在壯苗生根階段則會減少激素用量甚至不添加激素。研究認為,在類原球莖的誘導階段,添加生長素和細胞分裂素對類原球莖的誘導有利,添加細胞分裂素對原球莖的分化有促進作用。低濃度6-BA利于類原球莖增殖,而高于6.0mg/L的6-BA刺激多酚氧化酶作用,使類原球莖產(chǎn)生褐化。也有研究認為,1～8mg/L的6-BA能促進蝴蝶蘭類原球莖增殖,而濃度為0.1～0.5mg/L的6-BA則能促進類原球莖的分化。生根誘導時只需生長素即可。何子育等則認為在增殖、生根與壯苗階段不需加任何激素。彭立新等研究表明:在MS培養(yǎng)基中添加6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L有利于原球莖體的誘導,激素配比為6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭1.0g/L有利于原球莖體的增殖、提高增殖系數(shù),且不用轉(zhuǎn)接就可直接生根成苗,避免轉(zhuǎn)接過程帶來的污染損失,簡化了培養(yǎng)過程。曹君邁等對比了不同生長素對分枝型蝴蝶蘭種胚離體培養(yǎng)的影響,認為NAA在1.0～1.5mg/L濃度范圍內(nèi),比IBA更利于圓球莖的生長發(fā)育。除上述兩類激素外,GA3在組培中也有應(yīng)用:它對圓球莖分化有一定的抑制作用,可保持圓球莖的增殖能力。2.3使用高效糖代謝培養(yǎng)一般情況下,蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,是首選碳源。為節(jié)約生產(chǎn)成本,也可以用白糖、片糖等代替,效果有時比蔗糖還好。曾宋君等認為繼代培養(yǎng)時所需的碳源濃度比初代增殖與生根壯苗階段高,與謝峰的研究結(jié)論相反。培養(yǎng)基中糖濃度過高時,會為微生物生長繁殖創(chuàng)造條件,因此降低糖濃度可以一定程度上降低污染率,還能夠阻礙乙烯的生物合成,并提高試管苗移栽成活率,但降低糖濃度有使植株生長瘦弱、培養(yǎng)期延長的風險。近年來,關(guān)于代替?zhèn)鹘y(tǒng)糖類碳源的新型CO2無糖式光合培養(yǎng)模式逐漸成為研究熱點。提高培養(yǎng)容器內(nèi)CO2濃度主要采用增加容器透氣性或利用一些特殊的裝置將CO2直接或間接導入容器的方法。該方法要求培養(yǎng)材料必須含有一定的葉綠素來進行光合作用自養(yǎng),前期需要一定的設(shè)備投入。2.3.2活性炭對植物的生長作用用于清除植物組織在代謝過程中產(chǎn)生的不利或具毒副作用的物質(zhì),亦可調(diào)節(jié)激素的供應(yīng),促進植物生長。多數(shù)研究認為活性炭具有減緩褐化和促進生根的作用。在生根培養(yǎng)基中加入活性炭能抑制Ca+的吸收和防止褐變,有利于根的形成和生長,獲得根系較好的生根苗。周俊輝等研究表明,低濃度(0.5～1.0g/L)活性炭對原球莖增殖不明顯,高濃度(2.0～3.0g/L)時能促進原球莖增殖,但出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。需要注意的是,活性炭的吸附性是無選擇性的,不僅吸附有害物質(zhì)也能吸附激素,使用過程中要掌控好用量,使其既能最大程度的吸附有害物質(zhì),促進生根,又不影響植物的正常發(fā)育。另外,還需注意活性炭對培養(yǎng)基pH值有緩沖作用。2.3.3種常用植物的殺菌處理及對比研究為解決或防止有害微生物如細菌、真菌等侵染培養(yǎng)基造成污染發(fā)生,常在培養(yǎng)基中加入一些抑菌物質(zhì)。顧偉民等曾在蝴蝶蘭組培中,利用抗生素和醫(yī)用殺菌劑混合得出1種應(yīng)用多種植物的殺菌劑處理污染苗。抑菌物質(zhì)也可對外植體進行預處理或作為消毒接種工具。崔剛等從多種植物中提取具有殺菌、抗菌活性的物質(zhì),研制出具有廣譜性殺菌能力的抑生素,以此替代常規(guī)高溫高壓蒸汽滅菌環(huán)節(jié),降低成本。但是抗生素各有其抑菌譜,不同外植體所適宜的抗生素種類也不一樣,它們對組培苗生理生化作用及變異率的影響、怎樣最大程度的降低污染率等問題,仍需要在實踐中探索。2.3.4添加香蕉汁和椰子汁對原球莖生長的影響在蝴蝶蘭組培中,適當加入一些有機質(zhì)或天然物質(zhì),對誘導、增殖、生根都有很好的促進作用。王靜等研究發(fā)現(xiàn)水解酪蛋白對蝴蝶蘭原球莖增殖有明顯促進作用,但水解酪蛋白和香蕉勻漿混合卻對原球莖增殖有抑制作用。何松林等以白色花系蝴蝶蘭的原球莖為材料,研究了椰子汁、馬鈴薯汁和香蕉汁對原球莖幼苗分化的影響,結(jié)果表明,3種添加物均可提高原球莖的增殖率,其中椰子汁和馬鈴薯汁的效果優(yōu)于香蕉汁。王立婭依據(jù)中醫(yī)理論,添加5.5g/L蝴蝶蘭葉片勻漿研究其對增殖效果的影響,發(fā)現(xiàn)增殖效果顯著好于香蕉泥、椰汁。3培訓方法和條件3.1培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的作用組織培養(yǎng)方式有固體培養(yǎng)、半固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。培養(yǎng)基的形態(tài)對組織、細胞等外植體的生長過程、生長速度具有較大影響。通常情況下,固體培養(yǎng)基有利于誘導愈傷組織,而液體培養(yǎng)則有利于細胞和胚狀體增殖。在蝴蝶蘭的整個生產(chǎn)過程中,利用半固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)進行原球莖增殖,利用固體培養(yǎng)分化和生根,可增加繁殖系數(shù),降低污染,減少成本,有利于大規(guī)模生產(chǎn)。3.2光照、培養(yǎng)以及微生物環(huán)境的影響在蝴蝶蘭組培中,光照、溫度等環(huán)境因素對培養(yǎng)物的生長都有很大的影響。不同光譜的LEDs對蝴蝶蘭組培苗形態(tài)指標、色素含量、抗氧化酶系活性等都有影響。單色紅光處理的蝴蝶蘭組培苗徒長,單色藍光處理的組培苗根系活力最高。紅藍組合和單色藍光處理的葉片色素含量高于白光,可溶性糖、蔗糖、游離氨基酸和淀粉的含量及C/N(碳氮比)在單色藍光下均高于單色紅光處理。紅光能夠增加鮮重、干重,但會減少蝴蝶蘭葉綠素含量,不同光譜對根長的影響差異不顯著。陳菁瑛等認為在蝴蝶蘭葉片培養(yǎng)中,500lx光照培養(yǎng)有利于類原球莖的形成,1000lx或者完全黑暗條件不利于類原球莖誘導。一般常見的光照強度范圍為1000～2000lx。組培過程中溫度過低,形成類原球莖狀體所需時間較長,生長較慢;溫度過高,容易造成污染且易褐變。研究表明,蝴蝶蘭試管苗培養(yǎng)的適宜溫度為25℃,也有文獻指出花梗腋芽誘導時,25℃下容易出現(xiàn)花梗芽,28℃可以全部轉(zhuǎn)換為葉芽。生產(chǎn)中多為26(±2)℃。偏酸性的培養(yǎng)基更適合蝴蝶蘭生長發(fā)育,pH值多為5.0-6.5之間,在pH值5.0～5.4的環(huán)境中類原球莖生長最好,過酸或近中性的環(huán)境都不合適。經(jīng)過高溫滅菌后,培養(yǎng)基的pH值會降低,配制培養(yǎng)基時需注意。類原球莖增殖時切割或針刺有利于增殖而控制分化,否則類原球莖很容易分化和生根,增殖時切塊應(yīng)≥3mm,過小易褐化死亡。還有一些關(guān)于培養(yǎng)微環(huán)境如CO2、乙烯氣體的研究,包括在培養(yǎng)過程中,這些氣體的變化過程以及如何通過調(diào)節(jié)氣體來改善培養(yǎng)效果。此外,射線輻射對生長發(fā)育也有作用,Tanaka等認為0.2T的磁場系統(tǒng)能顯著增加類圓球莖的鮮重和干重。4植物生根壯苗蝴蝶蘭增殖與誘導常使用相似的培養(yǎng)基,養(yǎng)分濃度和激素水平變化不大。對于不同品種、不同外植體來說,沒有特別固定的培養(yǎng)基。如靖晶認為最適合蝴蝶蘭叢生芽增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方是MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L+100g/L香蕉泥,而譚巍等則認為是改良KC+NAA0.5mg/L+6-BA7mg/L+食用糖20g/L+瓊脂10g/L+活性炭2g/L。生根壯苗階段培養(yǎng)基傾向不加或少加激素,壯苗與生根也可以合為一個環(huán)節(jié)同時進行,培養(yǎng)時間常為2個多月。林宗鏗等對蝴蝶蘭生根壯苗的研究發(fā)現(xiàn),無機鹽是影響叢生芽發(fā)根率的主要因素,蔗糖次之,NAA與多效唑影響較弱,蝴蝶蘭生根壯苗最佳培養(yǎng)基為:花寶1號3.5g/L+NAA1mg/L+蔗糖25g/L+香蕉泥100g/L+蛋白胨2g/L+活性炭1g/L。朱紅華等認為生根培養(yǎng)基MS+NAA1mg/L+活性炭1.5g/L最好,這可能跟試驗品種或所選的基本培養(yǎng)基不同有關(guān)。蝴蝶蘭組培瓶苗煉苗方式采用室內(nèi)與室外結(jié)合3d+3d、4d+4d效果較佳。常用的移栽基質(zhì)包括水苔、椰絲、草炭等單一或混合基質(zhì),以水苔效果最好。有研究利用當?shù)爻Ｒ姷乃舍槨⑺蓸淦さ却嫠ψ鳛橐圃曰|(zhì),也有很高的成活率。楊少輝等研究表明,蝴蝶蘭適合水培移栽,大量元素配方為Ca(NO3)2·4H2O354mg/L+KNO3177mg/L+KH2PO457.5mg/L+MgSO4.7H2O185mg/L。5培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑等對褐變的控制褐化是蝴蝶蘭組培中最為常見的問題。有關(guān)蝴蝶蘭組培褐變機理的研究多集中在褐變過程中總酚含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性變化上。多數(shù)研究認為,褐變與總酚含量及PAL、PPO和POD活性呈正相關(guān)。趙瀅等對3個蝴蝶蘭品種(B3、15、F5)總酚含量的測定結(jié)果表明,F5品種總酚含量高,但褐變程度最輕,與上述結(jié)論不一致。印芳等研究不同元素對初代培養(yǎng)中褐變的影響發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中Fe、Cu濃度越高,褐化越嚴重;培養(yǎng)基中K、Ca、Zn隨濃度升高褐變越輕。常用的控制褐化的方法為在培養(yǎng)基中加入抑制褐化劑及控制培養(yǎng)條件等。抑制褐化劑主要分兩大類:活性炭、檸檬酸、聚乙烯毗咯烷酮(PVP)等吸附劑和維生素C、谷朧甘膚等抗氧化劑,生產(chǎn)應(yīng)用較多的是活性炭和PVP。培養(yǎng)條件上主要有黑暗培養(yǎng)和熱激處理。以培養(yǎng)基pH值6.5、培養(yǎng)溫度20℃、培養(yǎng)期間光強為1000lx、預暗培養(yǎng)10d以及接種前對外植體雙層膜遮光的減輕褐化效果較