蝴蝶蘭組培快繁體系的建立

蝴蝶蘭組培快繁體系的建立

1材料和方法1.1試驗材料1.2測試方法1.2.1花芽粉的制備用海藻酸鈉幼莖，橫切其段1.5.20cm（每個段有一個花芽），用75%酒精棉球清除表面灰塵。然后在洗衣粉中浸泡10~15min,期間不斷搖晃,再用自來水沖洗20~30min;在超凈工作臺上用75%的酒精浸泡10~30s;在0.1%升汞溶液中浸泡5~20min;無菌水沖洗3~7次,用無菌濾紙吸干花梗表面的水分,將花梗剪成長1.0~1.5cm的小段(每段帶1個花芽),接種到不同培養(yǎng)基上;先暗培養(yǎng)14~21d,然后再將其放入光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃,光/暗周期為14h/10h,光照強度2500~3500lx。1.2.2菌種誘導分化培養(yǎng)將消毒后的花梗或無菌苗的莖尖,在無菌條件下,將其切割成適當大小后,接種于不同的誘導分化和增殖培養(yǎng)基上,比較其萌發(fā)、生長、分化和增殖狀況。1.2.3培養(yǎng)基的制備當獲得的組培苗長到2~3cm時,將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.5mg/L上進行生根誘導,一個月后統(tǒng)計生根率、根的長度以及生根狀況等。所有培養(yǎng)基均附加10%椰子汁、0.1%活性炭、20g/L白砂糖和8g/L瓊脂,然后用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH值為5.4~5.6。在121℃條件下高壓滅菌13min。1.2.4集體苗的馴化和移植1.3激素貢獻率的方差分析:單因素方差分析,單因素方差分析為判定各種激素組合對蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)率、分化率、死亡率及腋芽組培苗莖尖分化率的影響,采用前向逐步回歸分析判斷各激素貢獻率及其顯著性、顯著因子,再用單因素方差分析各激素濃度對萌發(fā)率、分化率及死亡率的影響,采用單因素顯著性檢驗方差分析的顯著性。多元回歸分析和方差分析用Statistica6.0完成(StatSoft,Inc.)。2結果與分析2.1外植體萌發(fā)時間滅菌時間對外植體的消毒效果和成活率至關重要。用0.1%升汞消毒不同時間,花梗腋芽培養(yǎng)2~7d后,接種的一部分腋芽表面污染,一部分生長良好。滅菌時間短,污染率高,但長時間的消毒,對外植體的傷害較重,接種后外植體萌發(fā)時間相對較長。滅菌時間在15min時,污染率較低,萌發(fā)時間相對較早,滅菌時間在20min時,污染率雖然最低,但萌發(fā)時間延長(表1)。2.26不同濃度激素對植物根分發(fā)的影響在不同培養(yǎng)基上的蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)及生長結果表明(表2、表3),花梗腋芽在接種3d后,就出現(xiàn)萌動膨大現(xiàn)象(圖1A和圖1B),有的花梗腋芽在35d左右就長出小葉;有的在腋芽周圍突起,以后逐漸發(fā)育成幾個不定芽(圖1C)。這些不定芽芽大小不等,表明不定芽的分化不同步或生長發(fā)育不一致。激素種類和濃度對于花梗腋芽啟動培養(yǎng)有一定的影響。在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L上,蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)率最高,達40%。在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA5mg/L+NAA0.5mg/L上,花梗腋芽產(chǎn)生的不定芽數(shù)量最多,分化率最高,但整體長勢一般?？赡苁怯捎?-BA促進不定芽的形成,但影響了植株的長勢?；üＲ秆拷臃N后,在每種培養(yǎng)基上均有較高的死亡率,均是因為褐化造成的。這可能與蝴蝶蘭中含有較多的酚類物質(zhì)有關。多元回歸分析表明,NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā)率的影響基本相當,都沒有達到95%的顯著水平(結果未列出)。NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽死亡率的影響中,NAA和2,4-D都顯著影響死亡率,但NAA影響更強,6-BA不顯著。分別對NAA和2,4-D與死亡率做單因素方差分析,結果表明(圖2),NAA質(zhì)量濃度為0.2mg/L時蝴蝶蘭死亡率最高,濃度為0時死亡率最低。2,4-D兩個質(zhì)量濃度的方差分析結果不顯著。NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽分化率的影響中,6-BA的影響更為主要(達到95%顯著水平),單因素方差分析發(fā)現(xiàn),隨6-BA濃度增加(圖3),蝴蝶蘭花梗腋芽分化率增加。在附加不同濃度激素的MS培養(yǎng)基上,花梗腋芽萌發(fā)率較高(表3)。在培養(yǎng)基MS+6-BA2mg/L+2,4-D0.01mg/L上,萌發(fā)率為54.5%,分化率為18.2%,產(chǎn)生的芽數(shù)較多(圖1D)。2.3培養(yǎng)基對花椒腋芽組培苗莖尖的誘導效果將花梗腋芽組培苗的葉子剝?nèi)?切1.5~2.5mm莖尖,將其接種在附加不同激素種類和濃度的培養(yǎng)基上。結果發(fā)現(xiàn),有些莖尖顏色變綠,30d后上面出現(xiàn)顆粒狀的亮綠色的組織,這些組織逐漸長成類原球莖(圖4),2~3個月后,這些類原球莖有的長出小葉,有的繼續(xù)分化類原球莖(圖5)不同的培養(yǎng)基對花梗腋芽組培苗莖尖的誘導效果不同(表4)。在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA6mg/L+NAA0.2mg/L和1/2MS+6-BA5mg/L+2,4-D0.01mg/L上,莖尖的分化率最高,為50%。在前一種培養(yǎng)基上有16.7%誘導出類原球莖,33.3%誘導出不定芽。后一種培養(yǎng)基上只誘導出類原球莖在其他培養(yǎng)基上誘導率相對較低,多數(shù)外植體因褐化而死亡。多元回歸分析表明,TDZ、NAA、2,4-D和6-BA對蝴蝶蘭花梗腋芽組培苗莖尖分化率的影響中,6-BA和NAA對莖尖分化率影響較大(達到95%顯著水平),但6-BA影響更強,TDZ和2,4-D未達到顯著程度(多元回歸分析結果未列出)。分別對6-BA和NAA與莖尖分化率做單因素方差分析,結果表明,隨6-BA濃度增加,蝴蝶蘭莖尖分化率增加。NAA的方差分析結果并不顯著(圖6)。2.4培養(yǎng)基的性質(zhì)與增殖密度將類原球莖切成0.5cm2大小的塊,接種在附加不同濃度的NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),培養(yǎng)一段時間后,再進行切割轉(zhuǎn)移,通過這種方式使原球莖成倍增長。結果發(fā)現(xiàn)(表5),在培養(yǎng)基MS+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L上,類原球莖增殖倍數(shù)最高,為4.7,產(chǎn)生的類原球莖顏色為綠色,顆粒狀,隨著培養(yǎng)時間的延長,有的類原球莖變?yōu)槿辄S色(圖6)。因此,該培養(yǎng)基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基MS+6-BA10mg/L+NAA0.5mg/L上,原球莖在增殖的同時,有的產(chǎn)生大量叢生芽,但叢生芽長得較為弱小?？赡苁?-BA濃度過高導致的。因為細胞分裂素是一類較活躍的植物激素,它不僅能促進植物細胞的分裂和增大,而且在芽分化的誘導、葉綠體的發(fā)育、養(yǎng)分的運輸和分配、細胞衰老的抑制等方面都表現(xiàn)顯著的效果。試驗發(fā)現(xiàn),在增殖時一定要對類原球莖先切割后培養(yǎng),這樣效果比不切割的要增殖的數(shù)量多。原球莖分化比較容易,原球莖在增殖后較長時間不進行轉(zhuǎn)移就能出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。2.5集體培養(yǎng)和幼苗繁殖3培養(yǎng)基對類原球莖增殖的誘導率近年來,對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)報道較多的是以僅開一兩朵花且下面花芽飽滿的花梗、幼葉、莖尖和根尖等多種器官為外植體進行組織培養(yǎng)研究,但這些方法對母株都有不同程度的損傷。本研究選用的是幼嫩的花梗(為控制花期一致剪掉的花梗)作為外植體,經(jīng)過多次試驗,初步建立了組織培養(yǎng)再生體系。雖然誘導率相對較低,但這樣既不損傷母株,又可節(jié)約成本,充分利用材料,繁殖大量優(yōu)良品種,比采用蝴蝶蘭根尖、莖尖進行快速無性繁殖更有應用價值,特別是對一些稀有品種的保存和快繁。在植物組織培養(yǎng)中,外源生長素和細胞分裂素是細胞離體培養(yǎng)所必需的激素,合適的濃度及兩者之間的適宜配比不但可以誘導細胞分裂和生長,而且能控制細胞分化和形態(tài)建成。王麗艷等認為,激素是誘導組培苗增殖的關鍵物質(zhì),對培養(yǎng)的成敗起著決定性的作用。本研究結果證明激素種類和濃度對于花梗腋芽啟動培養(yǎng)有一定的影響。6-BA和NAA的共同作用可以促進蝴蝶蘭花梗腋芽萌發(fā),在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2mg/L+2,4-D0.2mg/L上,蝴蝶蘭花梗腋芽的萌發(fā)率最高。不同的培養(yǎng)基對蝴蝶蘭莖尖的誘導效果不同,較高濃度的6-BA有助于莖尖原球莖的誘導和增殖,濃度低誘導效果相對較差。在培養(yǎng)基1/2MS+6-BA6mg/L+NAA0.2mg/L和1/2MS+6-BA5mg/L+2,4-D0.01mg/L上,莖尖的分化率最高。在前一種培養(yǎng)基上有16.7%誘導出類原球莖,33.3%誘導出不定芽。后一種培養(yǎng)基上只誘導出類原球莖。在其他培養(yǎng)基上誘導率相對較低,多數(shù)外植體因褐化而死亡。在原球莖增殖培養(yǎng)過程中,在培養(yǎng)基MS+6-BA3mg/L+NAA0.2mg/L上,類原球莖增殖倍數(shù)最高,為4.7,產(chǎn)生的類原球莖顏色為綠色,顆粒狀。因此該培養(yǎng)基為蝴蝶蘭類原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基。金忠民等認為提高愈傷組織誘導率是建立再生體系的第一步,沒有高頻的誘導率,便無法得到大量的、高品質(zhì)的愈傷組織,其隨后的分化及生根也難以進行。對于蘭科植物來說,提高原球莖的誘導率則是建立再生體系的關鍵技術,本試驗原球莖的誘導率相對較低,有待于進一步深入研究提高類原球莖的誘導率。此外,越來越多的研究表明,蘭花類原球莖形成過程是典型的體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程,且是單細胞起源的。這為蘭科植物利用組織培養(yǎng)育種提供了理論基礎。組織培養(yǎng)也可以與化學誘變相結合的方法進行多倍體或抗性育種。在蘭科植物種質(zhì)資源創(chuàng)新方面具有較大的潛在應用價值。本研究為蝴蝶蘭的高頻再生組織培養(yǎng)體系建立、基因轉(zhuǎn)化、多倍體誘導或抗性育種奠定基礎。蝴蝶蘭(Phalaenopsisamabilis),又名蝶蘭,為蘭科蝴蝶蘭屬植物,其姿態(tài)優(yōu)美、色澤豐富、艷麗,花期持久。在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美稱,是蘭科植物中栽培最廣泛的四大觀賞熱帶蘭之一,是室內(nèi)綠化美化重要的觀賞花卉,國內(nèi)外市場對其需求量大。但是,由于蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭,很難用傳統(tǒng)分株方式進行無性繁殖;且蝴蝶蘭種子極小,沒有胚乳,發(fā)育不完全,極難萌發(fā)。組織培養(yǎng)作為生物技術育種的基礎,可以解決繁殖慢、種苗供不應求的難題。目前,隨著生物工程技術的廣泛應用,組織培養(yǎng)也已成為蘭花快速繁殖的重要手段。關于蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)有許多報道,這些研究多是以蝴蝶蘭的葉片、莖尖、花梗腋芽、種子、根尖、花梗節(jié)間為外植體進行組織培養(yǎng)研究,對以花梗為外植體的研究,大多是以未開花或即將開花的花梗為外植體,這對母株傷害較大,影響其觀賞價值和經(jīng)濟價值。本研究以較為幼嫩的廢棄的蝴蝶蘭花梗(為使花期一致,通常剪掉提前抽出的花梗)為外植體,在培養(yǎng)基上誘導休眠芽的萌發(fā),通過萌發(fā)的幼苗的莖尖為材料進行類原球莖的誘導、增殖、分化、生根,初步建立組