秋水仙素在植物多倍體誘導(dǎo)中的應(yīng)用

秋水仙素在植物多倍體誘導(dǎo)中的應(yīng)用

多倍體是指有三個以上完整染色體的生物個體。由于染色體數(shù)目加倍,個體外形往往具有巨大性,并且有適應(yīng)不利自然條件的能力,在生物進(jìn)化與育種上有重要意義。多倍體往往具有植株粗壯、葉大、花器官增大、花色更嬌艷、耐貯藏運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),增加了花卉的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。多倍體植株具有許多優(yōu)良的特性,而自然界產(chǎn)生多倍體的過程相當(dāng)漫長,因此人們常用人工誘導(dǎo)的方法獲得多倍體植株,分為物理方法和化學(xué)方法,物理方法效率太低,不能被廣泛利用,因而在多倍體的誘導(dǎo)研究中通常是用化學(xué)方法。誘導(dǎo)多倍體的化學(xué)藥劑很多,主要有秋水仙素、水合三氯乙醛、笑氣、富民隆等。被廣泛采用且最有效的藥劑是秋水仙素,因?yàn)榍锼伤氐淖饔弥痪窒抻谧璧K處于細(xì)胞分裂中期的紡錘絲的形成,而對染色體的結(jié)構(gòu)并無顯著影響,在遺傳上很少發(fā)生其他不利的變異。1誘導(dǎo)方法1.1整體植物誘導(dǎo)常用的方法有處理種子、胚根和生長點(diǎn)。1.1.1金魚草種子染色體變異類型設(shè)計(jì)用秋水仙素溶液直接浸泡種子,此方法簡便易行,但加倍功效較低,且容易產(chǎn)生嵌合體。用秋水仙素溶液處理金魚草種子,鏡檢發(fā)現(xiàn)變異植株的染色體多為嵌合體;用秋水仙素處理虞美人種子,產(chǎn)生多種變異類型,有四倍體、八倍體及嵌合體;用秋水仙素處理新疆雪蓮種子,變異植株全部為嵌合體,生長后期,絕大部分嵌合體由于根部畸形,無法吸收營養(yǎng),最終死亡,存活下來的少量嵌合體幼苗在不同程度上發(fā)生了回復(fù)突變。1.1.2不同植物種類對秋水仙素的應(yīng)用應(yīng)注意使用的單種子萌發(fā)后,用秋水仙素溶液浸泡種子胚根,該方法對材料有一定的傷害,不同植物種類對秋水仙素的敏感度不同。應(yīng)用時(shí)應(yīng)注意濃度和處理時(shí)間的選擇。用秋水仙素處理發(fā)芽1~2cm的枸杞種子,50%的植株具變異性狀,但大部分生長緩慢,最后死亡,四倍體只占6.7%。1.1.3秋水仙素對枸杞幼苗生長的誘變效果常用脫脂棉包裹幼芽,每日滴秋水仙素溶液,連續(xù)處理或間歇處理數(shù)日,或?qū)⑸L點(diǎn)浸泡在秋水仙素溶液中。與處理種子、胚根相比,處理更加直接,同時(shí)對材料的傷害較輕,誘變效果較好。以用濃度為0.5%的秋水仙素處理枸杞小苗的生長點(diǎn),連續(xù)處理72h或間歇處理36h,誘變率達(dá)27%,成苗的四倍體占13%和20%,與處理胚根法相比誘變效果顯著。將荷花種子破殼催芽,待第二葉開始長出后選擇長勢一致、生長正常的種苗,用脫脂棉包裹幼芽,每天滴0.05%秋水仙素溶液3~4次,處理96h,加倍效果不理想;但將荷花種子及芽全部浸泡在0.05%秋水仙素溶液中48h和72h,均獲得了良好的加倍效果。此外,將秋水仙素直接注射到郁金香花苞中下部的子房位置,也獲得了多倍體。1.2誘導(dǎo)分化成苗在無菌條件下用經(jīng)過濾滅菌的秋水仙素溶液浸泡離體植物組織,處理結(jié)束后用無菌水漂洗數(shù)次轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng),或?qū)⑼怆x體植物組織接種到添加了秋水仙素的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),一段時(shí)間后,再轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中,使其分化成苗。離體的植物組織包括小苗、莖段、叢生芽、愈傷組織、葉片等任何可分化成苗的器官及組織。1.2.1秋水仙素處理浸泡處理是秋水仙素對外植體作用最為直接的一種,材料的生長和分化在不同程度上受到抑制,甚至部分死亡。篩選適宜的處理濃度、時(shí)間組合是多倍體誘導(dǎo)的關(guān)鍵。以0.2%秋水仙素溶液處理番木瓜無菌苗72h效果好,誘導(dǎo)率最高達(dá)36.7%。將香石竹帶芽莖段浸泡在0.05%的秋水仙素溶液中50h,變異率達(dá)21.0%。用0.2%秋水仙素溶液浸泡花葉綠蘿叢生芽24h,誘變率達(dá)14.0%。將彩色馬蹄蓮的愈傷組織在0.05%秋水仙素溶液中浸泡24h,轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,誘導(dǎo)率最高達(dá)52.0%。葉片也可作為多倍體的誘導(dǎo)材料,取鄂柿的無菌葉片,沿中脈橫切成3~4塊,隨即放至0.5%的秋水仙素溶液中,在黑暗條件下振蕩處理96h,隨即轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,誘導(dǎo)獲得十二倍體再生植株。1.2.2大巖桐葉片誘導(dǎo)變/根用秋水仙素液體浸泡處理對外植體的傷害較直接,多次沖洗增加了外植體受污染的機(jī)會,秋水仙素加入培養(yǎng)基法避免了外植體的直接傷害,沖洗次數(shù)降低,也降低了受污染的幾率,所以日益受到科學(xué)工作者的青睞。將大巖桐葉片接種到20mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周,誘變率達(dá)62.5%,誘變效果優(yōu)于浸泡處理。將紅千層莖段接入含0.2%秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d和20d誘變效果最佳,達(dá)10.0%。用含有0.05%秋水仙素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)紅果冬青的叢生芽48h,變異率最高,達(dá)40.0%。2秋水仙素對多倍體的誘變效果秋水仙素的濃度是誘導(dǎo)多倍體的成敗關(guān)鍵之一,濃度過低,不能產(chǎn)生加倍效應(yīng),濃度過高則抑制植物材料生長甚至死亡,處理的濃度、時(shí)間因不同植物和同一植物的不同組織而異。在一定范圍內(nèi),秋水仙素濃度與處理時(shí)間同誘變效果呈正相關(guān),同植物材料存活率呈負(fù)相關(guān)。光照情況是影響多倍體誘導(dǎo)效果的第二顯著因素,試驗(yàn)探索得到,無光條件更利于多倍體誘導(dǎo)。溫度影響藥劑的水解速度,低溫條件下藥效減弱,高溫條件下藥效增強(qiáng)但對植物組織的損傷較大,變溫處理可提高誘導(dǎo)效果同時(shí)減輕對植物的傷害。滲透劑二甲基亞砜(DMSO)能促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中,能減輕秋水仙素的藥害作用,顯著提高秋水仙素的加倍效果并降低嵌合體的發(fā)生率,在作物的多倍體研究中得到了驗(yàn)證。此外,植物的不同組織、誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)前的狀態(tài)對誘導(dǎo)率也有影響。2.1不同濃度秋水仙素前處理對桉樹多倍體誘導(dǎo)效果的影響用秋水仙素溶液浸泡百合的鱗片、無菌試管苗、不定芽、叢生芽,均獲得了多倍體,濃度為0.02%~0.10%,誘變率在13.3%~50.0%,處理不定芽的誘導(dǎo)效果最佳,誘變率達(dá)50.0%。用秋水仙素溶液處理桔梗的愈傷組織,濃度為0.2%、處理時(shí)間為15h誘變效果最佳,但誘導(dǎo)率也不過為20.0%;用0.1%的秋水仙素處理其帶芽莖段40h,誘導(dǎo)率達(dá)50.0%。用0.05%秋水仙素溶液浸泡處理小葉綠蘿的不定芽72h,不定芽無死亡現(xiàn)象發(fā)生,誘導(dǎo)率達(dá)12.5%;而浸泡愈傷組織72h,死亡率可高達(dá)90.0%,且誘導(dǎo)完全不成功。用0.5%秋水仙素處理桉樹的單芽和叢生芽進(jìn)行多倍體誘導(dǎo),處理單芽120h時(shí)誘變率最高,達(dá)42.9%,死亡率也最高,達(dá)65.0%;處理叢生芽96h時(shí)誘變率最高,達(dá)38.5%,死亡率35.0%。叢生芽的誘導(dǎo)效果比單芽好。與莖段、葉柄相比較,葉片是毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)的最佳材料,經(jīng)秋水仙素處理后葉片最高存活率略低,但四倍體誘導(dǎo)率明顯高于莖段和葉柄。以庫拉索蘆薈的叢生芽、微塊莖、愈傷組織為材料,用秋水仙素濃度為0.05%的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,愈傷組織誘變的效果最差;叢生芽誘導(dǎo)效果較理想。2.2誘導(dǎo)方法2.2.1誘導(dǎo)率及誘導(dǎo)效果在培養(yǎng)基中添加一定濃度的秋水仙素,或者用秋水仙素浸泡處理植物材料一段時(shí)間再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中培養(yǎng),均可誘發(fā)多倍體的產(chǎn)生,不同植物種類的最佳誘導(dǎo)方法存在差異。用0.1%的秋水仙素處理貝母的愈傷組織24h,誘導(dǎo)率為47.0%;將其接種到含1000mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基中處理5d,誘導(dǎo)率最高達(dá)70.0%,誘變效果優(yōu)于浸泡處理。以不定芽為材料對金銀花進(jìn)行多倍體的誘導(dǎo),將其接種到添加秋水仙素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個月,以添加40mg·L-1秋水仙素處理組誘導(dǎo)率最高,為20.0%;用0.2%秋水仙素浸泡不定芽72h的誘導(dǎo)率僅15.0%。以種子為材料進(jìn)行杜仲多倍體的誘導(dǎo),研究表明,用秋水仙素處理后再進(jìn)行試管萌發(fā)處理,其多倍體的誘導(dǎo)率高于培養(yǎng)基中添加秋水仙素直接進(jìn)行試管萌發(fā)的處理。2.2.2倍體誘導(dǎo)率測定u將紅掌愈傷組織放入含200mg·L-1秋水仙素的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)14d,誘導(dǎo)率為45.45%,高于固體培養(yǎng)基處理的四倍體誘導(dǎo)率。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)研究中,雙層培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最好。剪秋羅的莖段接入含400mg·L-1秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng),液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)率和存活率高。2.3預(yù)處理的時(shí)間對誘導(dǎo)效果的影響由于秋水仙素見光易分解,誘導(dǎo)處理需在黑暗環(huán)境進(jìn)行,誘導(dǎo)前將材料置入黑暗環(huán)境進(jìn)行預(yù)處理的時(shí)間對誘導(dǎo)效果有一定的影響。在毛泡桐和白花泡桐四倍體誘導(dǎo)研究中,外植體的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對外植體存活率、芽誘導(dǎo)率和四倍體誘導(dǎo)率的影響皆達(dá)到極顯著水平。將茶樹幼苗先遮光黃化3d后再用秋水仙素處理生長點(diǎn)效果較好。3多倍體測試3.1外部形態(tài)的變化最簡單、最直觀粗放的鑒定方法,主要是觀察株高、莖粗、葉色及厚度、花冠、花藥及花粉、果實(shí)、種子等外部形態(tài)的變化。由于秋水仙素處理后會引起生長初期的表型畸變,所以在早期用形態(tài)特征指標(biāo)來鑒定多倍體是不可靠的。3.2整倍性的鑒定最直接、也是最準(zhǔn)確的鑒定方法。它不但能區(qū)分倍性而且還能鑒定是整倍性或非整倍性的變異。但技術(shù)性要求高,工作量大,而且實(shí)現(xiàn)的可能因植物而異。3.3氣孔大小和密度氣孔的大小、密度,保衛(wèi)細(xì)胞的長度、寬度及葉綠體的數(shù)目可作為多倍體鑒定的間接指標(biāo)。氣孔的大小與倍性呈正相關(guān),氣孔的密度與倍性呈負(fù)相關(guān)。以氣孔為指標(biāo)間接鑒定杜仲多倍體,與通過染色體記數(shù)法直接鑒定相比,其誤差不超過25%。認(rèn)為利用氣孔大小和密度來鑒定杜仲多倍體是一種相對可靠的方法。還可以作為鑒別渥丹百合多倍體、紅掌四倍體的可靠方法。如在同一植株或同一表皮上的氣孔大小差異明顯,此植株多為嵌合體,必須通過再次脫分化誘導(dǎo)不定芽的方法分離獲得純多倍體植株。3.4克氏原螯蝦多倍體的鑒定流式細(xì)胞術(shù)可以直接測定細(xì)胞核的DNA含量,測量精確、快速、重復(fù)性好,通過比較細(xì)胞核DNA含量來鑒定倍性較準(zhǔn)確,這種方法已被成功地用于蘋果、草莓、白花泡桐、美人梅、剪秋羅的倍性鑒別上。此外,李涵等用指紋圖譜分析法對齒瓣石斛多倍體進(jìn)行分析,研究表明正常二倍體與多倍體齒之間存在著明顯的差異,推斷在多倍體誘導(dǎo)過程中,存在著較多的加倍類型或少數(shù)染色體結(jié)構(gòu)的變異。王鴻鶴等對重瓣大巖桐多倍體進(jìn)行了過氧化物同工酶酶譜分析比較,但酶譜帶數(shù)與倍性之間無相關(guān)性,不能作為倍性進(jìn)行鑒定的指標(biāo)。李政等對綠玉樹不同倍性的植株進(jìn)行共有譜帶、特有譜帶的比較,研究發(fā)現(xiàn),二倍體綠玉樹的過氧化物酶同工酶譜帶僅有5條,而四倍體譜帶有8條,其中3條明顯加強(qiáng),僅能說明四倍體綠玉樹的過氧化物酶同工酶活性增強(qiáng)。4問題和視角的取消4.1其他植物對秋水仙素的抗性秋水仙素的作用機(jī)理在于它能抑制或妨礙細(xì)胞的紡錘絲形成,使分裂的染色體停留在赤道板,不向兩極移動,而細(xì)胞質(zhì)不分裂,導(dǎo)致染色體數(shù)目增加。秋水仙素對外植體有毒害作用,常常使材料的生長受到抑制或死亡。不同植物對秋水仙素的敏感程度不同,除處理濃度外還有多種因素共同影響誘導(dǎo)效果,綜合使用各方法可提高材料成活率和誘導(dǎo)率;不同植物或同一植物的不同部位也有差異,各種植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)有待完善。4.2染色體計(jì)數(shù)的有效方法染色體記數(shù)法是最直接、最準(zhǔn)確的鑒定方法,但技術(shù)性高,工作量大,對材料的狀態(tài)要求嚴(yán)格,只有處于旺盛分裂期的組織才能用于染色體計(jì)數(shù),實(shí)現(xiàn)的可能因植物而異。因此,找到一種簡單、快速、相對可靠的間接方法勢在必行。流式細(xì)胞術(shù)可以直接測