臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：1雙擴(kuò)、免疫電泳

沉淀反應(yīng)免疫實(shí)驗(yàn)室注意事項(xiàng)：1、必須穿白大衣進(jìn)實(shí)驗(yàn)室；2、實(shí)驗(yàn)中注意實(shí)驗(yàn)室秩序；3、如發(fā)生意外如損壞玻璃器材等，要及時(shí)報(bào)告；4、要節(jié)約實(shí)驗(yàn)藥品；5、實(shí)驗(yàn)后要回收的玻璃器材如載玻片等，放于指定陶瓷缸內(nèi)；廢紙及一次性用品棄于垃圾桶內(nèi)。6、實(shí)驗(yàn)完畢，清理桌面，保證實(shí)驗(yàn)試劑和器械放回原位。實(shí)驗(yàn)報(bào)告書寫格式一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；三、?shí)驗(yàn)材料；四、實(shí)驗(yàn)步驟；五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（畫圖+語言描述）；實(shí)驗(yàn)題目七、討論。二、主要原理；六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)2、免疫電泳3、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)4、對(duì)流免疫電泳24h后觀察結(jié)果

第一節(jié)沉淀反應(yīng)原理及特點(diǎn)

可溶性抗原(如血清、毒素、細(xì)菌浸出液等)與相應(yīng)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在的情況下，當(dāng)兩者比例合適會(huì)形成肉眼可見的白色沉淀物(沉淀線/環(huán)/弧/峰），稱為沉淀反應(yīng)。免疫濁度測(cè)定絮狀/環(huán)狀沉淀試驗(yàn)單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)流免疫電泳火箭免疫電泳免疫電泳液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z免疫電泳技術(shù)沉淀反應(yīng)可分三類單向擴(kuò)散試驗(yàn)雙向擴(kuò)散試驗(yàn)火箭電泳對(duì)流電泳免疫電泳第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一

一、雙向擴(kuò)散試驗(yàn)（平板法）將抗原和抗體放在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠板的對(duì)應(yīng)孔中，兩者各自向四周凝膠中自由擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相遇，并且相對(duì)應(yīng)時(shí)即發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例適當(dāng)處形成肉眼可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與擴(kuò)散的速度、濃度、純度、分子量等有關(guān)。原理瓊脂凝膠是一種半固體膠狀物，里面有無數(shù)小孔，Ag、Ab在孔中進(jìn)行擴(kuò)散，二者相遇，就會(huì)在比例適合處形成沉淀線，即為陽性反應(yīng)。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)臨床應(yīng)用雙孔型：Ag、Ab定性測(cè)定。三角型：Ag性質(zhì)分析梅花孔型：Ag有效稀釋度滴定1.抗原或抗體的存在與否及其相對(duì)含量的估算

出現(xiàn)沉淀線，表明存在相應(yīng)的抗原和抗體，沉淀線的形成是根據(jù)抗原抗體兩者比例所致，沉淀線靠近抗原孔，提示抗體含量高；靠近抗體孔，提示抗原含量較多。出現(xiàn)多條沉淀絨，則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此，雙向免疫擴(kuò)散可用于鑒定抗原或抗體的純度。2.抗原性質(zhì)的分析

臨床應(yīng)用3.抗原有效稀釋度的鑒定

臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)一雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（梅花孔型）檢測(cè)人白蛋白有效稀釋度制板打孔取3ml1.5%NS瓊脂預(yù)熱，傾注玻片，待凝固后打梅花孔。稀釋Ag

將白蛋白作對(duì)倍稀釋（原液、1：2、1：4、1：8、1：16）。加樣 中間孔加抗人白蛋白抗體;第1孔加NS；2、3、4、5、6孔分別加稀釋倍數(shù)為原液、1：2、1：4、1：8、1：16的稀釋Ag（HSA）。

4.擴(kuò)散標(biāo)記后置于濕盒，37C24h后觀察結(jié)果?？谷税椎鞍?23456明天中午結(jié)果觀察組別標(biāo)記【實(shí)驗(yàn)方法】制板方法取預(yù)熱3ml1.5%NS瓊脂傾注玻片，待冷凝后取走。

用刻度吸管吸取3ml溶化的NS瓊脂，右手托住刻度吸管傾斜45°，逐漸放開大拇指，緩慢沿著玻片的中線傾注液體，然后再涂滿邊緣。

保持所制凝膠板厚薄均一。打孔方法左手固定玻片，右手持打孔器垂直插入凝固的瓊脂凝膠中，緩慢輕輕原位旋轉(zhuǎn)，再沿著壓痕的邊緣挑去瓊脂。梅花孔：孔徑為3mm，孔間距在3～5mm之間。孔勿接近瓊脂的邊緣。

盡量打孔無裂痕，孔中瓊脂挑干凈加樣方法加樣量為10μl/孔，先加中央孔的Ab,換吸頭，再加NS，然后加Ag，依次是1：16、1：8、1：4、1：2及原液。加樣液體不能溢出，平孔沿，無氣泡，每孔液面基本保持一致。123456結(jié)果判定以出現(xiàn)沉淀線的抗原最高稀釋度作為抗原的有效稀釋度。(5)注意事項(xiàng)：A、打孔無裂痕，孔中瓊脂挑干凈；B、孔勿接近瓊脂的邊緣。

C、加樣不能溢出，無氣泡，每孔液面基本保持一致。第三節(jié)免疫電泳技術(shù)Ag區(qū)帶電泳＋雙擴(kuò)1、將蛋白質(zhì)類的復(fù)雜抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干Ag區(qū)帶

2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清（Ab）進(jìn)行雙向擴(kuò)散。原理二、免疫電泳先電泳，后擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)二免疫電泳試驗(yàn)檢測(cè)

人全血清成分及性質(zhì)制板將3ml1.5%BB緩沖液瓊脂傾注玻片，凝固后按紙樣打孔。加樣

、電泳將Ag（人全血清）加入小孔，置電泳槽中電泳，40V,50min）。擴(kuò)散電泳完后，取下玻片，劃槽，挑去槽內(nèi)瓊脂，加