向日葵菌防細(xì)菌s-16對精細(xì)菌的抑菌效果研究

向日葵菌防細(xì)菌s-16對精細(xì)菌的抑菌效果研究

向日葵病毒是由核糖菌（lib.）引起的一種重要的全球疾病，其中最嚴(yán)重的國家是加拿大、美國、阿根廷和中國。該病害在中國的內(nèi)蒙古、河北、山西、甘肅、新疆、陜西、寧夏及東北三省等向日葵產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生,并造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。該病原可侵染向日葵的根、莖、葉、花盤等多個(gè)部位,但病害發(fā)生以莖腐型和盤腐型為主,造成植株整體或局部腐爛死亡,甚至可導(dǎo)致部分地區(qū)絕收,嚴(yán)重影響向日葵的生產(chǎn)。核盤菌菌核能在土壤中長期存活,在不同環(huán)境條件下,可以形成營養(yǎng)菌絲體,或產(chǎn)生有性孢子進(jìn)行侵染,給菌核病的控制帶來了極大的困難。在防治方面,由于向日葵菌核病的抗病育種進(jìn)展緩慢,目前還沒有抗病品種和高效耐病品種?；瘜W(xué)防治主要使用的有多菌靈、速克靈和菌核凈等藥劑,但向日葵植株過于高大,田間用藥十分困難,藥劑對土壤中菌核效果有限,因此防治效果并不理想。在農(nóng)業(yè)防治方面,也缺少經(jīng)濟(jì)實(shí)用并且效果顯著的方法。從生物防治的角度,目前已經(jīng)獲得了大量用于核盤菌的生防菌株,但尚未得到能夠應(yīng)用抑制向日葵菌核病菌核形成并在我國向日葵主產(chǎn)區(qū)應(yīng)用和推廣的生防菌。本研究鑒定了1株分離自內(nèi)蒙古包頭市薩拉旗,能有效抑制向日葵核盤菌菌核形成的菌株S-16,并對其進(jìn)行了生防效果的初步研究。以期為向日葵菌核病的綜合防治探索新的手段,對將來的向日葵菌核病的生物防治研究提供材料和理論依據(jù)。1材料和方法1.1支護(hù)型學(xué)生的葵/回復(fù)突變菌的篩選生防細(xì)菌S-16分離自內(nèi)蒙古包頭市薩拉齊的向日葵根圍土壤;參比菌株CHA-4和T-5為實(shí)驗(yàn)室保存的向日葵核盤菌拮抗菌;向日葵菌核病菌S.sclerotiorum(Lib.)deBary由本實(shí)驗(yàn)室保存;試驗(yàn)所用向日葵品種為美葵LD5009由北京凱福瑞農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司引自美國福萊利公司(Flower)的食葵雜交種。1.2菌落生長前沿受抑制效果1.2.1對峙培養(yǎng)對核盤菌的作用將核盤菌菌種培養(yǎng)在PDA平板上,待菌落長至6cm直徑,用6mm打孔器打取生長良好的菌絲塊,接種于9cmPDA平板中央。在培養(yǎng)皿邊緣用穿刺法接種菌株S-16以及其他參比菌株,25℃下培養(yǎng)72h后觀察對核盤菌的抑制效果。并在顯微鏡下觀察菌落生長前沿受抑制的菌絲形態(tài)。1.2.2菌株S-16發(fā)酵濾液對核盤菌的作用將菌株S-16接入50mLLB液體培養(yǎng)基中,25℃下150r/min培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)液8000r/min離心10min,取上清,以孔徑0.22μm過濾器過濾得到發(fā)酵濾液。按不同比例將發(fā)酵濾液混入50℃融化的PDA培養(yǎng)基中,以普通PDA培養(yǎng)基為對照。當(dāng)培養(yǎng)基凝固后,在培養(yǎng)皿中心接入直徑6mm的核盤菌菌餅,25℃培養(yǎng)。待對照組菌落直徑達(dá)到6cm時(shí),顯微鏡下觀查菌落邊緣菌絲形態(tài)。15d后觀察菌核形成情況。1.3田間病斑、病斑直徑和防治效果的檢測1.3.1菌株S-16在離體葉片上的生防效果測定將菌株S-16接入50mLLB液體培養(yǎng)基中,25℃下150r/min培養(yǎng)48h。將菌液稀釋為約2×106cfu/mL菌懸液。取生長20d的向日葵幼苗第二對真葉,浸入菌懸液中1min,取出直至無可見液滴后將直徑6mm的核盤菌菌餅接于葉片表面,25℃保濕,每處理20片。以無菌水代替菌懸液為對照,重復(fù)3次。每12h測量病斑擴(kuò)展直徑,無癥狀記為0mm,計(jì)算防治效果。病斑直徑計(jì)算方法:病斑直徑=病斑測量直徑—菌餅直徑防治效果計(jì)算方法:防治效果(%)=(對照平均病斑直徑—處理平均病斑直徑)/對照平均病斑直徑×100%1.3.2菌株S-16在向日葵幼苗上的生防效果測定采用噴霧法將1.3.1方法得到的2×106cfu/mL菌懸液噴于生長20d的幼苗表面,核盤菌接種處理及對照與1.3.1中相同,室溫保濕培養(yǎng),每處理20株,重復(fù)3次。每24h統(tǒng)計(jì)一次病情指數(shù),計(jì)算防治效果。幼苗期向日葵菌核病分級標(biāo)準(zhǔn):0:全株生長正常;1:僅接菌葉片表現(xiàn)枯萎癥狀;2:病斑蔓延至莖桿;3:3片以上的葉片枯萎;4:全部葉片枯萎,植株直立;5:全株壞死。病情指數(shù)計(jì)算方法:病情指數(shù)=∑(各級代表數(shù)值×各級病株數(shù))×100防治效果計(jì)算方法:防治效果(%)=(對照病情指數(shù)—處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%1.4s序列及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建1.4.1分子生物學(xué)鑒定菌株16SrDNAPCR擴(kuò)增按照鐘衛(wèi)鴻的方法;8F和1492R通用引物序列參照Galkiewicz和Kellogg的報(bào)道,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成;PCR產(chǎn)物測序工作由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司完成。所測序列登錄GenBank數(shù)據(jù)庫,使用Blast程序進(jìn)行相似性比較。從LPSN(ListofProkaryoticnameswithStandinginNomenclature)檢索模式菌株,再由GenBank中得到相應(yīng)16S序列,與所測得菌株S-16的16S序列一起輸入MEGA4.0程序以Neighbor-Joining(進(jìn)化樹法)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.4.2生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中芽孢菌屬的鑒定方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)、革蘭氏染色、乙酰甲基甲醇(V.P)、接觸酶、卵磷脂酶、硝酸鹽還原、好氧厭氧特性的鑒定,同時(shí)使用法國生物梅里埃公司API50CHBV3.0實(shí)驗(yàn)條得出碳源利用生化譜,做出生理生化鑒定結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1抑菌帶周圍核盤菌生長與形貌的變化2.1.1對峙培養(yǎng)對核盤菌的作用在菌株S-16與向日葵核盤菌對峙培養(yǎng)中,抑菌帶寬為(8.0±2.0)mm,拮抗效果明顯。靠近菌株S-16抑菌帶附近的核盤菌在較大范圍內(nèi)不能形成菌核及菌核原基(sclerotialinitials)且菌落衰弱;而參比菌株CHA-4和T-5,無論拮抗作用強(qiáng)弱,抑菌帶周圍核盤菌氣生菌絲生長繁茂且能夠形成菌核與菌核原基(圖1)。在顯微鏡下觀察菌株S-16抑制的核盤菌菌絲可以發(fā)現(xiàn)(圖2),菌絲早期在生長點(diǎn)附近出現(xiàn)叢狀分支(圖2B),在接近生防菌處核盤菌菌絲尖端還會(huì)出現(xiàn)囊泡狀畸形(圖2C-1)并伴有細(xì)胞壁破裂(圖2C-2)的現(xiàn)象。2.1.2菌株S-16發(fā)酵濾液對核盤菌的作用核盤菌在混有菌株S-16發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基上菌落生長衰弱、緩慢且形態(tài)發(fā)生變化。核盤菌在發(fā)酵濾液濃度高于1%的固體PDA上無法形成菌核,菌落形態(tài)呈氈狀,并且在40d內(nèi)沒有菌核形成。將受抑制(培養(yǎng)基發(fā)酵濾液濃度10%)而不能產(chǎn)生菌核的菌絲轉(zhuǎn)于正常PDA培養(yǎng)基,菌絲正常存活并可以產(chǎn)生菌核(圖3)。當(dāng)對照組菌落直徑達(dá)到6cm時(shí),在顯微鏡下觀察各處理菌落邊緣菌絲形態(tài)。含有菌株S-16發(fā)酵濾液(濃度1%)培養(yǎng)基上的核盤菌菌絲(圖4B)與正常菌絲(圖4A)相比,表面粗糙,延伸扭曲,局部出現(xiàn)絞纏(圖4B-1)和瘤狀突起(圖4B-2)。2.2植株s-16對葵核盤菌細(xì)菌的效果2.2.1菌株S-16在離體葉片上的防治效果向日葵幼苗葉片接種核盤菌12h后,對照處理的葉片上開始出現(xiàn)癥狀,而經(jīng)菌株S-16菌液處理的葉片直至36h后癥狀才逐漸顯現(xiàn)。48h后,對照平均病斑直徑達(dá)到22.32mm,多數(shù)幼苗葉片已經(jīng)完全腐爛,而此時(shí)菌株S-16菌液處理后的向日葵幼苗葉片的平均病斑直徑僅為1.20mm,防效達(dá)到94.62%(表1)。說明菌株S-16能夠有效控制核盤菌菌絲對葉片組織的侵染。2.2.2菌株S-16在向日葵幼苗上的防治效果菌株S-16發(fā)酵濾液和清水分別噴施在向日葵幼苗上然后接種核盤菌,結(jié)果表明,對照組從接種核盤菌24h后即可觀察到病斑,72h后全部發(fā)病,120h后病情指數(shù)達(dá)到63.33。菌株S-16菌液處理組在72h有零星植株發(fā)病,直至120h病情指數(shù)僅為3.67,防病效果可達(dá)94.21%(表2)。2.3s-16的生理生化鑒定2.3.116srDNA序列分析結(jié)果菌株S-16的16SrDNA(1226bp)在GenBank進(jìn)行相似性比對(登錄號lcl|60155),結(jié)果表明菌株S-16與多種枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis有較高的同源性,相似率均在97%以上。其中與菌株B.subtilisstrainA23相似度最高,為98%。以MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),可以看出菌株S-16與芽孢桿菌屬的細(xì)菌處于一個(gè)大分支內(nèi),其中又與枯草芽孢桿菌模式菌株B.subtilisstrainDSM10遺傳距離最為接近,聚類置信系數(shù)為99。2.3.2S-16的生理生化鑒定結(jié)果菌株S-16在LB固體培養(yǎng)基上24h的菌落形態(tài)圓形,直徑約為2.5~3.0mm,奶油色,不透明;菌體成短桿狀,革蘭氏陽性,菌體0.8×(1.8~3.0)μm,偶見成短鏈,產(chǎn)生中生芽孢,孢囊不膨大;周生鞭毛,至少為6根;產(chǎn)生乙酰甲基甲醇(V.P陽性);接觸酶陽性,卵磷脂酶陰性;還原硝酸鹽;嚴(yán)格好氧;又經(jīng)API50CHBV3.0鑒定得到S-16的表型譜(表3)。所得生理生化特性與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中枯草芽孢桿菌各項(xiàng)鑒定指標(biāo)相符,又經(jīng)APILAB軟件分析,得到該菌株為枯草芽孢桿菌,ID(identification)為94.6%。結(jié)合分子鑒定和生理生化鑒定可確認(rèn)菌株S-16為枯草芽孢桿菌。3菌株s-16對葵核菌核生長的影響研究表明,分離自內(nèi)蒙古主產(chǎn)區(qū)向日葵根圍土壤中的菌株S-16對核盤菌菌絲生長以及菌核形成有很強(qiáng)的抑制效果。對峙培養(yǎng)中抑菌帶寬為(8.0±2.0)mm,并使抑菌帶邊緣菌絲形態(tài)發(fā)生變化。在菌株S-16發(fā)酵濾液濃度高于1%的培養(yǎng)基上,核盤菌不能形成菌核,且菌落形態(tài)衰弱并呈均勻的氈狀。通過API微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定、16SrDNA序列分析和生理生化指標(biāo)測定,菌株S-16為枯草芽孢桿菌B.subtilis。在以往利用生物防治手段防治菌核病的報(bào)道中,僅有少數(shù)關(guān)于生防菌抑制油菜核盤菌和絲核菌Rhizoctoniasolani菌核形成的報(bào)道。本研究篩選到的生防菌株S-16能夠顯著抑制向日葵核盤菌S.sclerotiorum菌核的形成,其抑制機(jī)制除了產(chǎn)生較強(qiáng)的抑菌物質(zhì)外,還可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)(揮發(fā)性物質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)及機(jī)制正在研究中),該物質(zhì)不僅對于核盤菌的菌絲有抑制作用,更重要的是可以抑制菌核的形成,表現(xiàn)出防治菌核病的潛力,具有進(jìn)一步研究