影響植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素

影響植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的因素

自20世紀80年代以來，轉(zhuǎn)移技術(shù)及其在植物遺傳改良中的應(yīng)用引起了科學(xué)家的興趣。人們嘗試利用不同轉(zhuǎn)化方法對植物進行改良,如基因槍介導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道、電擊穿孔等,培育了抗蟲棉花、抗蟲玉米、抗除草劑大豆、抗除草劑油菜、抗病毒木瓜、延熟番茄、高維生素含量水稻、抗旱小麥等轉(zhuǎn)基因植物新品種和新材料,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用。其中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)是比較成熟、應(yīng)用比較廣泛的轉(zhuǎn)化方法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的生物轉(zhuǎn)化體系,自從Zambryski等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化機理和應(yīng)用逐漸得到人們的關(guān)注。農(nóng)桿菌包括根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes),它們是兩類寄主非常廣泛的土壤細菌,分別攜帶Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)和Ri質(zhì)粒(rootinducingplasmid),兩種質(zhì)粒上都含有一段可轉(zhuǎn)入植物細胞內(nèi)的T-DNA(transferDNA),在自然狀態(tài)下通過侵染受傷的植物組織,將T-DNA上的目標基因轉(zhuǎn)入植物細胞,進一步進入細胞核,整合到受體材料的染色體上。其轉(zhuǎn)化具有一定的主動性,且具有操作簡單、成本低、轉(zhuǎn)化DNA片段明確、基因拷貝數(shù)低、發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默相對較少、轉(zhuǎn)移的基因片段較長、轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點。但農(nóng)桿菌介導(dǎo)存在受體基因型特異性、組織培養(yǎng)過程容易污染、重復(fù)性不強等問題,在一些植物上的應(yīng)用受到限制。目前,除了大多數(shù)雙子葉植物以外,很多單子葉植物也可以利用農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的范圍在不斷擴大,但傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在很大程度上依賴組織培養(yǎng)和共培養(yǎng)技術(shù)。事實上,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與植物細胞之間相互作用的結(jié)果,包括農(nóng)桿菌附著、Vir誘導(dǎo)、T-DNA加工、T-DNA和相關(guān)Vir蛋白進入受體細胞的細胞質(zhì)、T-復(fù)合體在細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運和進入細胞核、T-復(fù)合體卸載包裝、T-DNA整合、T-DNA基因表達和植株再生等眾多復(fù)雜的步驟。凡是影響農(nóng)桿菌侵染能力、植物細胞應(yīng)答農(nóng)桿菌侵染能力,以及轉(zhuǎn)化體再生能力的各種因素都將直接影響轉(zhuǎn)化效果。對一些難轉(zhuǎn)化的植物來說,輔助因素對轉(zhuǎn)化的成敗及其效率起著至關(guān)重要的作用,這些輔助因素不但可以促進農(nóng)桿菌對受體細胞的侵染,而且能夠減輕農(nóng)桿菌侵染后導(dǎo)致的植物細胞褐化死亡現(xiàn)象,促進T-DNA的轉(zhuǎn)運和向受體基因組上的整合,從而達到提高植株再生率和轉(zhuǎn)化效率的目的。本文就影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的有關(guān)輔助因素,如抗氧化劑使用、干燥處理、微創(chuàng)傷處理、核基質(zhì)附著序列和表面活性劑使用等方面的研究進行了綜述,為進一步改進農(nóng)桿菌介導(dǎo)難轉(zhuǎn)化植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率提供參考。1超聲波輔助農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)農(nóng)桿菌在植物細胞壁表面的吸附和附著位點是農(nóng)桿菌與植物細胞相互作用的關(guān)鍵。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的一個主要步驟是為T-DNA轉(zhuǎn)入受體細胞創(chuàng)造一個合適的條件或環(huán)境。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化過程中進行超聲波和負壓輔助處理有助于提高轉(zhuǎn)化效率,兩種微創(chuàng)傷處理方法的原理都是在外植體的表面產(chǎn)生微傷口,使外源基因容易進入。微創(chuàng)傷處理強度太大會影響植株的再生,太小則達不到應(yīng)有的效果,均影響轉(zhuǎn)化效率的提高。因此,在研究中需要探索超聲波和負壓處理的強度、時間等參數(shù)。超聲波輔助處理對外植體的傷害主要來自2個方面,一是超聲波造成外植體損傷,Santarém等利用顯微鏡觀察到經(jīng)過超聲波處理的大豆子葉表面和深層有大量的微小傷口,隨超聲波處理時間的延長,外植體損傷趨于嚴重,可能由超聲波的空化效應(yīng)引起,空化作用具有瞬時性和穩(wěn)定性。在超聲波處理過程中,在液相介質(zhì)里形成許多小氣泡,這些小氣泡達到一定大小后就會爆裂,爆裂產(chǎn)生的震動波或引起的介質(zhì)快速運動足以對細胞和大分子物質(zhì)造成機械損傷,因此在組織表層細胞壁和細胞膜上產(chǎn)生許多微小的傷口;二是由于超聲波的熱化作用,超聲在介質(zhì)中傳播時產(chǎn)生的能量會使介質(zhì)的溫度升高,從而對外植體造成傷害。高強度的超聲波可導(dǎo)致細胞破碎和酶失活,但超聲波處理強度和時間適宜時,細胞自身能修復(fù)細胞壁和細胞膜的損傷,因而不影響細胞的生物活性。Trick等首次將超聲波技術(shù)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中,建立了超聲波輔助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)(sonication-assistedAgrobarterium-mediatedtransformation,SAAT),即對在農(nóng)桿菌菌液中的外植體進行短時間的超聲波處理。他們研究了SAAT對大豆未成熟種子、豇豆嫩葉、玉米未成熟胚、小麥和白云杉種子轉(zhuǎn)化效率的影響,發(fā)現(xiàn)所有供試材料經(jīng)SAAT處理后都顯著提高了GUS瞬時表達率,而沒有經(jīng)SAAT處理的對照材料中GUS瞬時表達率則較低。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)SAAT處理的外植體其細胞壁和細胞膜上存在許多微傷口,而沒有經(jīng)SAAT處理的組織表面仍保持光滑、完整,且隨著SAAT處理時間延長,傷口由1μm左右增大到1mm左右,這些小傷口足以使農(nóng)桿菌侵入到植物組織內(nèi)部,從而使GUS的平均瞬時表達頻率提高了至少100倍。SAAT轉(zhuǎn)化技術(shù)已在大豆、麻類等植物中成功應(yīng)用,提高了轉(zhuǎn)化效率。此外,由于植物組織受到創(chuàng)傷,促使酚類物質(zhì)分泌增加,也促進農(nóng)桿菌向植物細胞的附著,進而提高了T-DNA轉(zhuǎn)入植物細胞的幾率。Georgiev等用35kHz超聲波處理毛蕊花的葉片,轉(zhuǎn)化效率隨處理時間不同而變化,處理45s時轉(zhuǎn)化率最高,60s時反而觀察到壞死現(xiàn)象,說明超聲處理時間加長或超聲程度增加對植物組織產(chǎn)生了破壞作用。目前,超聲波處理是一些植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的主要輔助技術(shù),依據(jù)處理材料的差異,選擇合適的超聲儀器、超聲波頻率、時間和緩沖液等,能夠刺激新芽的再生,提高農(nóng)桿菌侵染效率及最終的轉(zhuǎn)化效率。但也存在特別的例子,如在小麥幼穗組織的轉(zhuǎn)化中,雖然GUS瞬時表達的外植體數(shù)目增多,但平均每個外植體上GUS表達的藍色斑點數(shù)卻減少。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中,改變受體材料所處環(huán)境中外界壓強的負壓輔助處理,可以明顯提高農(nóng)桿菌對植物細胞的轉(zhuǎn)化效率。負壓處理的原理也是在植物組織表面形成許多微小傷口,同時促使細胞分泌一些酚類物質(zhì),從而有利于農(nóng)桿菌吸附,并且激活T-DNA的轉(zhuǎn)移。而且負壓處理可使農(nóng)桿菌通過細胞之間的間隙進到深層的細胞組織,從而提高轉(zhuǎn)化效率。但過度的負壓處理也會對細胞造成傷害,不利于提高轉(zhuǎn)化效果。畢瑞明采用切傷的小麥成熟胚為外植體,在農(nóng)桿菌侵染過程中利用注射器進行負壓處理,證明小麥成熟胚的轉(zhuǎn)化效率得到提高。Mani等將辣椒幼嫩葉片經(jīng)負壓(400—600mmHg)處理后,GUS瞬時表達率增加。水稻、結(jié)縷草、苜蓿、花生、松樹等植物在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中使用負壓處理,都不同程度地提高了轉(zhuǎn)化效率。植物組織經(jīng)超聲波處理后再使用抽真空進行負壓處理,可能會為農(nóng)桿菌進入組織提供更多機會,與共培養(yǎng)只在植物組織表面細胞的轉(zhuǎn)化相比,可使農(nóng)桿菌在植物組織內(nèi)部進行轉(zhuǎn)化。Sailaja等用香蕉氣生根為材料,研究了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中超聲波與負壓方法結(jié)合處理對轉(zhuǎn)化效果的影響,結(jié)果表明,6min超聲波處理,結(jié)合6min負壓處理,GUS瞬間表達率高達39.4%,處理時間繼續(xù)延長不僅沒有提高GUS表達率,反而不利于抗性再生植株的獲得。deOliveira等以柑橘上胚軸莖段為材料進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)對受體材料進行2s超聲處理后再進行10min抽真空處理,與不處理對照及各自分別處理相比,GUS瞬時表達率顯著提高,該結(jié)果與在四季豆中獲得的結(jié)果相似,表明2種創(chuàng)傷處理結(jié)合對提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的效果更加明顯,但其作用程度在不同植物和基因型間存在差異。2抗氧化酶系統(tǒng)過氧化氫(H2O2)、羥自由基(·OH)和超氧自由基(O2-)等活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)是植物細胞發(fā)生氧化反應(yīng)的副產(chǎn)物,影響細胞正常的新陳代謝及生長發(fā)育,這種影響對植物細胞的再生過程具有雙重作用,一方面,氧化脅迫引發(fā)植物體內(nèi)相關(guān)的抗氧化酶類的合成,促進植株再生;另一方面,發(fā)生氧化脅迫的細胞其細胞膜通透性改變,進而引發(fā)細胞功能的紊亂,甚至導(dǎo)致細胞死亡。細胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),包括各種抗氧化劑酶類,如過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX)等,能夠抑制ROS的產(chǎn)生。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過程中,農(nóng)桿菌侵染即對植物細胞施加了逆境,植物細胞容易產(chǎn)生過氧化物,導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化脅迫,影響植物組織存活和再生。同時,ROS也影響農(nóng)桿菌的生長,進而阻止農(nóng)桿菌對植物組織的侵染。過氧化物的積累引起細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中POD和CAT等酶類活性增強,以抑制氧化反應(yīng)的加劇。在被農(nóng)桿菌侵染的小麥組織中,顯微鏡下可觀察到明顯的細胞褐化死亡現(xiàn)象,嚴重影響了外源基因向小麥中的轉(zhuǎn)化。研究表明,培養(yǎng)基中添加一些抗氧化劑,如硝酸銀(AgNO3)、半胱氨酸(cysteine,Cys)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)、抗壞血酸(vitamineC,Vc)、甘氨酸甜菜堿(glycinebetaine,GB)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和硫辛酸(lipoicacid,LA)等,作為非酶類去除活性氧的清除劑,能夠延遲或阻止蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物及DNA的氧化,使細胞免受進一步傷害,減少植物組織褐化和死亡,有利于植物組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的再生。AgNO3是一種強還原劑,有助于減輕農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程中植物細胞內(nèi)部的氧化反應(yīng),阻止植物細胞褐化死亡。王秀紅等比較了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米所用培養(yǎng)基中添加不同濃度AgNO3對愈傷組織誘導(dǎo)及愈傷組織質(zhì)量的影響,表明AgNO3能減緩細胞中褐變物質(zhì)的分泌,使培養(yǎng)基保持透明,5mg·L-1AgNO3對誘導(dǎo)胚性愈傷組織及改善愈傷組織質(zhì)量的效果最好,對提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的效率具有積極作用。但趙東等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹葉片的試驗中卻得到了相反結(jié)果,共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AgNO3的濃度與GUS瞬間表達率成反比,認為可能是由于過量銀離子對農(nóng)桿菌產(chǎn)生了毒害作用,抑制了農(nóng)桿菌的生長和侵染。Packer等發(fā)現(xiàn),LA作為一種參與幾個多酶復(fù)合體的含硫物質(zhì),能防止細胞中的代謝物質(zhì)被氧化產(chǎn)生酚類物質(zhì),降低組織壞死程度。LA比較容易通過滲透穿過細胞壁,改進植物組織被農(nóng)桿菌侵染后轉(zhuǎn)化細胞的存活率和再生率,從而顯著提高一些轉(zhuǎn)化比較頑固的植物,如小麥、大豆、棉花等的轉(zhuǎn)化效率,但不同植物L(fēng)A適宜用量和效果不同。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥、大豆和番茄的培養(yǎng)基中,LA的適宜濃度分別為50、250和10μmol·L-1,小麥轉(zhuǎn)化率從2.8%提高到5.7%,大豆轉(zhuǎn)化率從0.6%提高到3.7%,番茄轉(zhuǎn)化率從29.8%提高到87.0%。GB和GSH能保護植物的芽器官免受非生物脅迫。GB能維持細胞膜的完整性,外源GB能提高細胞抗脅迫能力。GSH是許多氧化還原反應(yīng)中的有效因子,其作用是作為細胞的保護劑及促進細胞分裂。PVP能防止組織褐化,培養(yǎng)基中添加PVP可減輕植物組織褐化程度,Figueiredo等證實PVP能聚集受傷組織中產(chǎn)生的酚類物質(zhì)。Dutt等研究了LA、PVP、GSH、GB對檸檬農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響,表明在分化培養(yǎng)基中加入50μmol·L-1LA能顯著提高轉(zhuǎn)化率(比對照提高約4倍),GB的作用適中,GSH和PVP對轉(zhuǎn)化效果影響不明顯,但隨著抗氧化劑濃度的增加,轉(zhuǎn)化率有所下降,可能是由于高濃度的抗氧化劑影響了電子傳遞系統(tǒng),破壞了能量代謝或分配。吳珊等將AgNO3和PVP一起用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化茶樹葉片培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率提高。Cys也具有抑制植物組織褐變的作用,在共培養(yǎng)基中添加Cys能顯著提高佛手抗性愈傷組織誘導(dǎo)率。Olhoft等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉的培養(yǎng)基中添加了硫代硫酸鈉、Cys和DTT,提高了GUS的轉(zhuǎn)化效率。汲逢源等在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆下胚軸的培養(yǎng)基中加入了硫代硫酸鈉、Cys和DTT,降低了外植體的褐化和死亡,大幅度提高了GUS瞬時表達效率。Liu等研究了Cys對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆效率的影響,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入600mg·L-1Cys對改進大豆轉(zhuǎn)化效率的作用最好。在小麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方面,于惠敏等以小麥胚性愈傷組織為受體材料,研究了DTT和PVP對轉(zhuǎn)化效果的影響,發(fā)現(xiàn)在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加DTT0.10%—0.15%、PVP1.00%時的作用最為明顯,且DTT的效果優(yōu)于PVP。Enríquez-Obregón等發(fā)現(xiàn),在甘蔗莖節(jié)的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加15mg·L-1Vc、40mg·L-1Cys、2mg·L-1AgNO3,對提高轉(zhuǎn)化效率具有較好的作用。綜上所述,在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物組織的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基或共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入合適種類和濃度的抗氧化劑能夠減少植物組織褐化,提高轉(zhuǎn)化效率。3間相互作用的全方位調(diào)節(jié)在表達載體上插入與T-DNA在植物細胞內(nèi)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和整合有關(guān)的序列或基因,對提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的效率具有潛在作用。其中,核基質(zhì)附著序列(matrixattachmentregions,MAR;scaffoldattachmentregions,SAR)最受關(guān)注,目前已從酵母、植物、動物中分離出了多個MAR。MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍的DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的邊界,參與染色質(zhì)的活動,調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),通過本身具有的分割作用使每個轉(zhuǎn)錄單元保持相對的獨立性,免受周圍染色質(zhì)的影響,可能與細胞核穩(wěn)定性有關(guān)。另外,MAR結(jié)合蛋白與核小體結(jié)合的組蛋白競爭,使染色體打開,有助于基因的表達。MAR也可能會影響到DNA的重組。MAR序列中有一段富含AT的區(qū)域,稱為BURs(base-unpairingregions),能夠降低由超螺旋引起的負面影響,此外還含有A-boxes、T-boxes、解旋位點等元件。研究發(fā)現(xiàn),并不是所有的MAR對基因表達起正調(diào)節(jié)作用,有的反而降低基因的表達。許多因素對MAR的作用產(chǎn)生影響,如當DNA解旋酶和拓撲異構(gòu)酶結(jié)合到MAR的特定區(qū)域時,能夠使DNA雙鏈打開形成單鏈,破壞MAR的功能;臨近的啟動子和RNA聚合酶與MAR間的相互作用能增強基因的表達等。最近,Zhang等從煙草中分離到一個新的MAR,命名為TM2,發(fā)現(xiàn)TM2中含有與DNA動態(tài)變化相關(guān)的元件,同時受多種元件的協(xié)同調(diào)節(jié),TM2還能調(diào)節(jié)核小體打開,其功能的實現(xiàn)有賴于目的基因的本底表達能力,證明TM2能夠提高外源目標基因在水稻和煙草中的表達水平。將TM2分別添加到GUS完整表達框兩側(cè),利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草葉片,發(fā)現(xiàn)GUS表達增強,且減少了轉(zhuǎn)基因的沉默現(xiàn)象,TM2串聯(lián)重復(fù)添加到GUS表達框兩側(cè)時,GUS表達進一步提高,但在煙草愈傷組織中的效果不如葉片明顯,可能是細胞生長狀態(tài)影響了MAR作用。在GUS表達框一側(cè)添加反向TM2情況下,與對照載體相比GUS表達同樣提高,且啟動子上游添加效果優(yōu)于終止子下游,說明TM2是一個雙向調(diào)節(jié)元件,5′-MAR比3′-MAR效果更好。TM2不但可以增強外源目標基因在受體植物中的表達水平,而且能夠提高轉(zhuǎn)化效率。利用啟動子上游和終止子下游均含有TM2的表達載體分別轉(zhuǎn)化水稻和煙草,水稻的轉(zhuǎn)化效率比對照載體提高了1.5倍,煙草的轉(zhuǎn)化效率比對照提高了1.7—2.1倍,轉(zhuǎn)化效率的提高可能是由于TM2增強了載體上nptⅡ篩選標記基因的表達水平,提高了轉(zhuǎn)基因植株的篩選效果。但在將adh1轉(zhuǎn)化玉米的研究中發(fā)現(xiàn),將MAR序列構(gòu)建到adh1上游才能發(fā)揮作用,在chn50轉(zhuǎn)化煙草的試驗中也存在類似情況。Han等將來自煙草的MAR序列連接到含GUS的雙元表達載體上,利用農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化煙草和白楊,發(fā)現(xiàn)GUS表達水平在白楊中提高了近10倍,在煙草中提高了2倍,也提高了白楊再生芽抗卡那霉素篩選劑的能力。此外,在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化中,也有利用MAR提高轉(zhuǎn)化效率的類似報道。為了提高外源DNA進入植物細胞后的穩(wěn)定性和向基因組中整合的效率,在目標基因表達框兩側(cè)添加MAR序列是一種行之有效的策略。農(nóng)桿菌侵染植物細胞是一個復(fù)雜的過程,涉及一系列在農(nóng)桿菌染色體上或質(zhì)粒上存在的與附著到植物細胞表面和T-DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的Vir毒性基因。研究表明,Vir表達受到植物信號分子如乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)等酚類化合物的誘導(dǎo)。其中,VirA是結(jié)合在農(nóng)桿菌細胞內(nèi)膜上的受體蛋白,能對植物產(chǎn)生的酚類物質(zhì)產(chǎn)生感應(yīng),包含一段C端胞質(zhì)域,有自激酶的功能,可在組氨酸殘基上發(fā)生自磷酸化,這種發(fā)生了磷酸化的VirA蛋白可將其磷酸基轉(zhuǎn)移給VirG蛋白,使ViG蛋白活化。VirG蛋白也稱為DNA結(jié)合活化蛋白,具有激活其它Vir轉(zhuǎn)錄的作用。VirB幫助T-DNA轉(zhuǎn)運并提供能量。VirD決定內(nèi)切酶的活性,與T-DNA復(fù)合體的形成和加工相關(guān)。VirC負責(zé)對T-DNA邊界序列缺口的剪切,當VirD表達不足時,VirC也可對T-DNA進行加工。Lu等最近發(fā)現(xiàn),VirC2蛋白C端第82—202位氨基酸鏈能夠形成一個Ribbon-helix-helix(RHH)DNA結(jié)合區(qū),該區(qū)域發(fā)生變化時嚴重影響T-DNA與VirC2的結(jié)合,降低T-DNA在植物中的轉(zhuǎn)化效率。VirE在T-DNA轉(zhuǎn)移過程中保護其免受核酸酶的降解,VirD2和VirE2與T-復(fù)合體的形成及轉(zhuǎn)移有關(guān)。在植物中已鑒定出與農(nóng)桿菌VirE2蛋白互作的蛋白VIP1(VirE2-interactingprotein1),其不與VirD2蛋白互作,發(fā)現(xiàn)VirE2蛋白進入植物細胞受VIP1共表達的誘導(dǎo),后者進一步幫助T-DNA復(fù)合體從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核,以及向染色體上的整合,與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物密切相關(guān),并從擬南芥中克隆了VIP1。Anand等應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù),在擬南芥中鑒定出與VirE2互作的另一個蛋白VIP2,該蛋白含有一個NOT結(jié)構(gòu)域,體外試驗證明VIP2與VIP1相互作用,轉(zhuǎn)錄分析證明VIP2具調(diào)節(jié)子的功能。Wu等利用含額外拷貝VirG、VirB、VirC的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化硬粒小麥新鮮幼胚,轉(zhuǎn)化率0.6%—9.7%,利用含輔助質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化普通小麥,轉(zhuǎn)化率為0.3%—9.0%,表明農(nóng)桿菌中Vir過表達可以提高轉(zhuǎn)化植物的效果。類似的試驗中,用含有額外Vir載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化火炬松成熟胚,GUS瞬時表達率高達92.8%。Hansen等利用含VirG發(fā)生突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草葉片和玉米嫩芽,提高了GUS轉(zhuǎn)化率,證明農(nóng)桿菌中毒性基因的突變促進了轉(zhuǎn)化。Tzfira等首先將來源于擬南芥中VIP1的反義基因轉(zhuǎn)入煙草,利用含反義VIP1的煙草植株重復(fù)轉(zhuǎn)化GUS,發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌不能侵染含反義VIP1的煙草葉片,阻止了癭瘤形成;T-DNA表達的早期階段被阻斷,VirE2蛋白在細胞核內(nèi)的積累急劇降低,沒有GUS表達,轉(zhuǎn)化率顯著下降。進一步將過表達擬南芥VIP1的表達載體轉(zhuǎn)入煙草,利用過表達VIP1的煙草植株重復(fù)轉(zhuǎn)化GUS,發(fā)現(xiàn)GUS表達率和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率與對照相比顯著提高,證實VIP1確實具有促進T-DNA轉(zhuǎn)運和提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的作用。同樣,將煙草中的VIP2沉默或使擬南芥中的VIP2突變(Atvip2),農(nóng)桿菌侵染煙草和擬南芥后T-DNA的轉(zhuǎn)化效率大大降低,說明VIP2是T-DNA在植物細胞中穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運和整合必需的因子。4農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的金屬酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)表面活性劑是數(shù)目眾多的一類化合物,有天然的表面活性劑,也有人工合成的表面活性劑,在農(nóng)藥、化工、印刷、紡織、食品等方面應(yīng)用廣泛。表面活性劑可以作為一種滲透劑,使植物細胞質(zhì)膜變得敏感,溶質(zhì)較易進入。表面活性劑可以分為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑和非離子表面活性劑四大類。由于非離子表面活性劑對植物來說毒性最低,因此在生物研究中應(yīng)用比較普遍。表面活性劑有2個主要特征:一是表面活性劑分子具有雙親結(jié)構(gòu),對有機物具有強的親和力;二是表面活性劑分子在較低濃度下就能吸附在兩相界面上,明顯降低界面張力,使高分散系統(tǒng)趨于穩(wěn)定。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中,表面活性劑可以通過減小表面張力增加農(nóng)桿菌在受體細胞上的吸附,而且可以通過其對細胞膜通透性的影響提高T-DNA的轉(zhuǎn)運效率。Clough等在研究擬南芥植株水平蘸花轉(zhuǎn)化法的影響中,發(fā)現(xiàn)Silwet-77表面活性劑明顯提高了轉(zhuǎn)化效率,農(nóng)桿菌侵染液中加入0.005%—0.1%Silwet-77的轉(zhuǎn)化效果高于抽真空處理,但濃度再高則引起組織壞死,認為合適的濃度為0.05%。Curtis等研究了不同種類和濃度表面活性劑對利用農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化蘿卜效果的影響,認為菌液中加入0.05%Silwet-77時轉(zhuǎn)化效果最好,PluronicF-68和Tween20相比對照也都提高了轉(zhuǎn)化效率。Cheng等在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法首次獲得轉(zhuǎn)基因小麥的研究中,證明共培養(yǎng)液中添加適當濃度Silwet和PluronicF-68對農(nóng)桿菌侵染和T-DNA進入小麥細胞具有積極作用。Tween20和TritonX即使很低的濃度對小麥幼胚愈傷組織也有傷害。然而,Chhabra等發(fā)現(xiàn),農(nóng)桿菌侵染液中加入0.2%Tween20能提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織的效率,但濃度大于0.2%時GUS瞬時表達率急劇下降。Wu等分析了共培養(yǎng)液中不同濃度Silwet-77對小麥幼胚存活率、愈傷組織誘導(dǎo)率及GUS表達率的影響,發(fā)現(xiàn)隨著Silwet-77濃度的增加GUS表達率提高,但濃度大于0.06%時所有幼胚死亡,認為Silwet-77用量0.01%比較適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化小麥幼胚。Kim等研究了TritonX100、Tween20和SilwetL-77對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥離體葉片效果的影響,發(fā)現(xiàn)菌液中3種表面活性劑的濃度0.01%左右時,GUS的表達率顯著提高,其中加入0.01%TritonX100或Tween20時GUS表達率提高約1.6倍,但濃度高于0.05%引起葉片萎蔫,嚴重影響轉(zhuǎn)化效果。Liu等對影響大豆子葉節(jié)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素進行了研究,表明共培養(yǎng)液中SilwetL-77的適宜濃度為0.02%,配合添加600mg·L-1Cys并在22℃條件下進行侵染,之后采用合理的篩選步驟,轉(zhuǎn)化效率提高到3.8%—11.7%。Yang等對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化玉米幼胚愈傷組織的技術(shù)體系進行了優(yōu)化,確定菌液中含有0.01%—0.02%SilwetL-77最適合玉米幼胚的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。Suzuki等在麝香蘭胚轉(zhuǎn)化試驗中加入了0.1%Tween20,發(fā)現(xiàn)GUS表達率明顯提高。因此,在農(nóng)桿菌侵染液中添加適宜濃度的表面活性劑對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物是有益的。但在受體材料預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中使用表面活性劑,試圖通過改變外植體侵染前的生理狀態(tài)以提高外源基因轉(zhuǎn)化率的有效性,還需要進一步驗證。5小麥胚性愈傷組織/受害者組織間的相互作用受體組織的狀態(tài)將影響其農(nóng)桿菌侵染后的存活和再生能力,適當?shù)母稍锾幚砜纱偈怪参锝M織失水,提高滲透勢,刺激分裂,使隨后產(chǎn)生的愈傷組織生長旺盛、分化能力增強。在利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大多數(shù)植物的程序中都包括在濾紙上吸去外植體表面液體的步驟,即進行干燥處理。延長干燥處理的時間,變化干燥處理的方式,并在共培養(yǎng)階段對植物組織和農(nóng)桿菌進行干燥處理,對提高再生率和轉(zhuǎn)化率都有作用。但干燥時間過長,細胞過度失水,愈傷組織不能恢復(fù)生長而導(dǎo)致死亡;干燥時間過短,愈傷組織僅失去表層水分,達不到風(fēng)干細胞和提高轉(zhuǎn)化的效果。農(nóng)桿菌侵染前后對外植體進行干燥處理其再生和轉(zhuǎn)化效果不同。Polin等采取不同干燥處理方法,研究了干燥處理對美洲栗幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響,將經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的幼胚均勻擺放到無菌濾紙上逐漸干燥或?qū)⒂着咴诔瑑襞_內(nèi)風(fēng)吹干燥,發(fā)現(xiàn)干燥處理能顯著提高綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的表達率。Zhang等將農(nóng)桿菌侵染后的美洲栗胚性組織在濾紙上干燥處理2d,將對真菌具有抗性的小麥草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)入了美洲栗,轉(zhuǎn)化率得到提高,認為共培養(yǎng)條件是提高轉(zhuǎn)化效率的重要因素。Cheng等首次將小麥幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)采用了僅在濾紙上進行的方式,研究了干燥濾紙上添加0—500μL無菌水對GUS表達、愈傷組織生長和農(nóng)桿菌生長的影響,發(fā)現(xiàn)200μL以下用量的無菌水顯著提高了GUS表達率,50μL時效果最好(每個外植體的藍色斑點數(shù)為139.3,對照為33.9)。干燥共培養(yǎng)處理不僅促進了T-DNA轉(zhuǎn)移,而且促進了細胞的恢復(fù)生長,共培養(yǎng)后100%的幼胚都能存活并快速生長,而對照處理只有60%—80%的存活率,且恢復(fù)生長較慢。另外,干燥共培養(yǎng)處理顯著抑制了農(nóng)桿菌過度生長,農(nóng)桿菌數(shù)目比對照降低了約3倍。最終,干燥處理顯著提高了小麥幼胚轉(zhuǎn)化效率,比對照提高7倍左右(干燥處理為12.4%,對照為1.6%)。該研究還證明,受體材料高滲透壓處理、脫落酸(abscisicacid,ABA)處理和侵染前干燥處理均不能達到共培養(yǎng)期間干燥處理顯著提高轉(zhuǎn)化效率的效果。但另外的試驗發(fā)現(xiàn),小麥胚性愈傷組織在農(nóng)桿菌侵染前進行30min的干燥處理,抗性愈傷組織獲得率明顯提高,干燥處理時間過長則效果相反,說明農(nóng)桿菌侵染前對受體組織進行適當時間的干燥處理也有利于提高轉(zhuǎn)化效率。Ding等將農(nóng)桿菌侵染后的小麥成熟胚愈傷組織在濾紙上干燥共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌生長受到抑制,不但提高了T-DNA的轉(zhuǎn)運,而且促進了愈傷組織分化。丁莉萍等將小麥成熟胚愈傷組織在濾紙上與農(nóng)桿菌共培養(yǎng),GUS瞬時表達率達90%,證實干燥共培養(yǎng)的愈傷組織含菌量少,有利于后續(xù)培養(yǎng)階段對農(nóng)桿菌的控制和受體組織的再生,提高轉(zhuǎn)化效率。甘蔗外植體被農(nóng)桿菌侵染前在超凈臺中風(fēng)15—60min,然后進行轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)GUS轉(zhuǎn)化率提高,干燥處理30min效果最好,超過60min將對外植體造成不可逆的傷害。水稻成熟胚愈傷組織在農(nóng)桿菌侵染前風(fēng)干處理10—15min得到了相似結(jié)果,轉(zhuǎn)化率至少提高了10倍。李笑寒等通過在培養(yǎng)基上鋪墊濾紙方式對水稻愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)階段進行干燥處理,發(fā)現(xiàn)由于降低了共培養(yǎng)環(huán)境中的水分含量,增加了農(nóng)桿菌與植物細胞間的接觸,抑制農(nóng)桿菌生長,提高了轉(zhuǎn)化率。Chaudhary等將棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到無篩選劑的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)30—40d,在此培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基會逐漸干燥,相當于對外植體進行了緩慢的干燥處理,再將經(jīng)干燥處理的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上,重復(fù)此步驟直到出現(xiàn)再生芽,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率大大提高。在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化荔枝的研究中,曾黎輝等對荔枝胚性愈傷組織在轉(zhuǎn)化前進行干燥預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)由于吸去了組織表面的水分,有利于菌液充分進入細胞間隙,對提高荔枝轉(zhuǎn)化效率有一定促進作用。6其它影響農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的因素盡管許多植物利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了成功,但對大多數(shù)植物來說轉(zhuǎn)化效率依舊很低,亟待建立高效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng),以便加速利用基因工程途徑對植物進行遺傳修飾的步伐。目前為止,雖然對農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的影響因素進行了大量研究,但很多結(jié)果缺乏重復(fù)性,如本課題在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥幼胚和成熟胚的培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和表面活性劑等并沒有取得預(yù)期效果,超聲波處理促進農(nóng)桿菌侵染小麥幼胚和成熟胚的效果也并不明顯(資料未發(fā)表)。至于受體植物材料在農(nóng)桿菌侵染前、共培養(yǎng)階段和侵染后進行干燥處理后均能提高不同植物轉(zhuǎn)化效率的解釋,多數(shù)研究認為干燥處理抑制了農(nóng)桿菌的過度生長,引起植物細胞發(fā)生了輕微質(zhì)壁分離,促進了T-DNA轉(zhuǎn)入和植物細胞恢復(fù)生長,但干燥處理提高轉(zhuǎn)化效率的機理仍不清楚,有待深入探討。另外需要指出的是,在一種植物或外植體上取得的結(jié)果往往不能在其它植物或外植體上普遍應(yīng)用,需要根據(jù)不同植物、基因型和外植體類型,進一步優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的影響因素,尤其是共培養(yǎng)階段的輔助處理技術(shù)。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加AS被認為是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物取得突破的關(guān)鍵,但抗氧化劑使用、表面活性劑使用和干燥處理也是不容忽視的環(huán)節(jié)。對于一些轉(zhuǎn)化非常困難的植物,可能需要綜合運用微創(chuàng)傷、干燥、抗氧化劑和表面活性劑等處理,優(yōu)化試驗方案。除了前面所述的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的輔助因素之外,近幾年對影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的其它因素進行了探討。Khanna等利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥幼胚后,發(fā)現(xiàn)在分化培養(yǎng)基中添加0.1mol·L-1亞精胺后促進了抗性愈傷組織生長和植株再生,轉(zhuǎn)化率提高了2倍以上。Boyko等在擬南芥和煙草的轉(zhuǎn)化中證明,將MS培養(yǎng)基中的硝酸銨用量增加2—3倍,明顯促進了T-DNA向受體細胞中的轉(zhuǎn)化和向染色體上的重組,轉(zhuǎn)化率提高3倍左右,認為高濃度硝酸銨的存在有利于增強T-DNA在轉(zhuǎn)移過程中的完整性。進一步研究了氯化鉀和稀土元素對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥和煙草的影響,