大鼠急性心肌梗死模型的建立

大鼠急性心肌梗死模型的建立

21世紀(jì)醫(yī)學(xué)必須盡快解決的問題之一。由于MI的許多病理生理資料難以從臨床研究中獲得,其防治上的進(jìn)展有賴于基礎(chǔ)研究上的突破。MI動物模型的建立是開展基礎(chǔ)研究的第一步,它對于研究人類MI的病理生理變化、心電生理改變以及評價各種治療方法具有重大價值。結(jié)扎左前降支制作MI模型,是一個被廣泛接受近于成熟的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。但隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,它的一些操作步驟、評價指標(biāo)等方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上作了相應(yīng)的改進(jìn),以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象建立MI動物模型,方法操作簡單、模型成功率高、重復(fù)性好,為下一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。1對象和方法1.1動物d大鼠20只,1.清潔級雄性Spreague-Dawley(SD)大鼠20只,體質(zhì)量250～300g(275±15.3)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組和心肌梗死組。1.2學(xué)習(xí)方法1.2.1病例對照治療氯胺酮(75mg/kg)腹腔注射麻醉,經(jīng)口人工呼吸(導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間),連接小動物呼吸機(jī)予以正壓通氣,潮氣量3～5ml/100g,呼吸頻率60次/min,吸呼比1∶1。左側(cè)胸部備皮,消毒手術(shù)區(qū)域,經(jīng)胸骨左緣第4肋間開胸,鈍性分離肌肉,以眼科開瞼器撐開肋間肌切口,暴露心臟,剪開心包,于肺動脈圓錐與左心耳之間距主動脈根部2～3mm處,用7-0眼科無創(chuàng)縫合針,穿過前降支深部連同一小束心肌一并結(jié)扎。根據(jù)心電圖和心肌組織顏色確定冠脈結(jié)扎成功。逐層縫合胸壁,自主呼吸恢復(fù)后拔出通氣導(dǎo)管。大鼠清醒后送動物房飼養(yǎng),規(guī)律照明,自由進(jìn)食和飲水。術(shù)后連續(xù)3d予以青霉素40萬U腹腔注射以預(yù)防感染。假手術(shù)對照組除不結(jié)扎冠狀動脈外,其余步驟相同。1.2.2梗死區(qū)變薄指數(shù)mi組3%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉,用PhilipsSonos5500型多功能超聲診斷儀(S12探頭,頻率5～12MHz),在胸骨旁以二維超聲和M型超聲測量左室收縮末徑(LVSd)、左室舒張末徑(LVDd)、舒張期左室后壁厚度(PWd)、舒張期左室前壁厚度(AWd,MI組為梗死區(qū)室壁厚度)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和短軸縮短率(FS),分別計(jì)算梗死區(qū)變薄指數(shù)(BBZS,即舒張期左室前壁厚度/后壁厚度)和非梗死區(qū)增厚指數(shù)(ZHZS,即舒張期左室后壁厚度/前壁厚度)。所有參數(shù)均在3個連續(xù)的心動周期中進(jìn)行測量并取平均值。1.2.3壓力傳感檢測3%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉,氣管切開插管,保持呼吸道通暢。分離右側(cè)頸總動脈,插入2F聚乙烯導(dǎo)管,0.3%肝素生理鹽水抗凝,將壓力傳感器與BL-420E生物信號采集與處理系統(tǒng)連接,測量并記錄頸總動脈收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP),向前推送導(dǎo)管至左心室測量左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等參數(shù)。1.2.4改變左、右心室實(shí)際重量各項(xiàng)檢查完成后,經(jīng)股靜脈注入10%KCl2ml,使心臟停搏于舒張期,迅速取出心臟,PBS液洗去血液,濾紙洗凈水分后用電子天平(精確到0.1mg)分別稱取左、右心室實(shí)際重量(LVAW、RVAW),計(jì)算其與體質(zhì)量(BW)的比值,得到左、右心室相對重量(LVRW、RVRW)。將心臟從心尖到心底沿長軸橫切4等分,4%多聚甲醛固定24h后分別石蠟包埋。各取一張5μm的病理切片作HE染色。用HPIAS彩色病理圖文分析系統(tǒng)測量每張切片的心內(nèi)膜緣總長及心梗部位心內(nèi)膜緣長度,計(jì)算梗死面積。組織切片常規(guī)Masson染色,隨機(jī)選取4個不含血管視野,用ImageProPlus5.0圖像分析軟件計(jì)算膠原容積積分(collagenvolumefraction,CVF)。1.2.5統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1跳呼吸停術(shù)后大鼠存活率MI組大鼠14只,術(shù)中死于心室顫動和心跳呼吸驟停4只,術(shù)后1周死亡1只(心力衰竭),存活4周大鼠共9只,存活率為64.3%。6只假手術(shù)組大鼠全部存活。2.2mi成功復(fù)制證據(jù)2.2.1淺促、節(jié)拍時抗冠脈結(jié)扎術(shù)后大鼠精神萎靡呈蜷縮狀、活動較少、呼吸淺促、抓起時反抗較輕,毛發(fā)枯槁呈黃白色、多見倒豎,進(jìn)食量明顯減少;同期假手術(shù)組大鼠術(shù)后1d即恢復(fù)至術(shù)前的食欲和運(yùn)動量,毛發(fā)平滑而有光澤。2.2.2肢體心肌運(yùn)動變化冠脈結(jié)扎即刻,縫線下方心肌色澤變白,局部心肌運(yùn)動減弱,心電圖提示肢導(dǎo)聯(lián)R波振幅明顯升高,ST段弓背向上抬高0.2mV以上。結(jié)果見圖1。2.2.3橋橋橋橋橋橋橋橋橋橋橋橋點(diǎn)心肌細(xì)胞代謝性假手術(shù)大鼠心肌細(xì)胞橫紋及閏盤清晰,纖維結(jié)構(gòu)清楚、排列整齊、無炎癥細(xì)胞浸潤;冠脈結(jié)扎術(shù)后4周非梗死區(qū)心肌細(xì)胞代償性肥大,纖維組織增生、排列紊亂、炎癥細(xì)胞浸潤明顯,部分心肌細(xì)胞肌漿嗜伊紅性增強(qiáng)。結(jié)果見圖2。測量所得MI組大鼠的梗死面積在40%～45%之間(平均42%)。2.2.4mi組左室左室非梗死區(qū)膠原纖維的變化假手術(shù)組心肌組織膠原纖維少,無條索狀及融合的膠原纖維;MI組左室非梗死區(qū)膠原纖維顯著增多,呈條索狀,分割包繞心肌束、部分膠原纖維融合。結(jié)果見圖3。2.3qp、ws、lvef和fs的變化與假手術(shù)組比較,MI大鼠LVSd、LVDd和ZHZS明顯增加(P<0.01),PWd、AWd、BBZS、LVEF和FS明顯降低(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見表1。2.4hr和lvedp的測定與假手術(shù)組比較,MI大鼠SBP、DBP、LVSP、±dp/dtmax均顯著降低(P<0.01),HR和LVEDP顯著增加(P<0.01),結(jié)果見表2。2.5住宅重建指標(biāo)與假手術(shù)組比較,MI大鼠左、右心室實(shí)際和相對重量以及CVF均明顯增加(P<0.01),結(jié)果見表3。3mi模型制備的成功因素MI動物模型的制作有多種方法,各有利弊,也因人而異。早期國外多采用Johns法,即在自主呼吸條件下,不用呼吸機(jī)支持,迅速開胸?cái)D出心臟行冠狀動脈結(jié)扎。這種方法需要在極短的時間內(nèi)完成操作,技術(shù)要求高,難度大,難以掌握;而且由于心臟移位,容易導(dǎo)致血流動力學(xué)紊亂和心律失常等并發(fā)癥;開胸后小動物呼吸無法得到保證,因而手術(shù)死亡率極高。此后Fisbein和Pfeffer在Johns法的基礎(chǔ)上略加改進(jìn),應(yīng)用小動物呼吸機(jī)維持呼吸,明顯提高了手術(shù)的成活率。目前常用的氣道建立方法有:氣管切開、經(jīng)口氣管插管、經(jīng)口人工呼吸(導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間)、面罩呼吸等。氣管切開法雖然操作容易,但術(shù)后呼吸道并發(fā)癥多,大鼠難以長期存活。經(jīng)口氣管插管相對較難,技巧性大,需要有麻醉插管經(jīng)驗(yàn),如果不熟練,一次插管不成功,反復(fù)操作刺激大鼠喉部,易使其喉部粘膜水腫,氣道分泌物增加,導(dǎo)致氣道阻塞甚至窒息死亡。本實(shí)驗(yàn)在小動物呼吸機(jī)支持下,經(jīng)口人工呼吸(導(dǎo)管置于大鼠的舌體與上頜之間),操作簡便,且可在開胸后為冠狀動脈結(jié)扎贏得較長時間,術(shù)后呼吸道并發(fā)癥少。經(jīng)口人工呼吸中,氣體經(jīng)口腔進(jìn)入胃腸是常見的問題,但不影響動物存活。人工呼吸前采用小腹帶繃扎腹部,可明顯減少氣體進(jìn)入胃腸。與此同時本實(shí)驗(yàn)以眼科開瞼器充分撐開肋間肌切口,不但手術(shù)視野清晰,易于操作,而且避免心臟移位和血流動力學(xué)紊亂,明顯減小心臟損傷和心律失常等的發(fā)生。準(zhǔn)確結(jié)扎是MI模型制作成功的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)以左心耳和肺動脈圓錐為標(biāo)志,在距主動脈根部2～3mm處結(jié)扎冠狀動脈,定位準(zhǔn)確,重復(fù)性好。熟練后從開胸至縫合整個過程可在1min內(nèi)完成,結(jié)扎成功率高,術(shù)后存活率也高。造模4周后,大鼠心臟左室前壁可見瘢痕組織,超聲心動圖示梗死區(qū)心肌運(yùn)動減弱,非梗死區(qū)心肌、室間膈和右室明顯肥厚,左室腔擴(kuò)張。HE染色和Masson染色示非梗死區(qū)纖維組織增生、排列紊亂、伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤。血流動力學(xué)檢查示左室收縮和舒張功能下降。提示MI動物模型建立成功。試驗(yàn)中MI組各大鼠的梗死面積在40%～45%之間(平均42%),表明實(shí)驗(yàn)均一性良好。MI模型制備過程中存在麻醉、氣道建立、呼吸機(jī)參數(shù)調(diào)節(jié)、冠狀動脈結(jié)扎等易導(dǎo)致造模失敗