中山大學(xué)課件-病毒學(xué)研究方法

病毒學(xué)研究方法病毒培養(yǎng)方法形態(tài)學(xué)研究方法免疫學(xué)(血清學(xué))方法生化、生物物理與分子生物學(xué)方法1、體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二十世紀(jì)中期動物細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立，極大推動了動物病毒學(xué)研究的發(fā)展原代成纖維細(xì)胞建株成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞原代成纖維細(xì)胞建株成纖維細(xì)胞上皮細(xì)胞Pigkidneycells(IBR-S2)growingonCytodex1.VerocellsgrowingonCytodex1.人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞72小時收毒第3天MDCK細(xì)胞Vero細(xì)胞培養(yǎng)接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞48小時接種細(xì)胞60小時Vero細(xì)胞接種PEDV病毒病變過程照片Vero細(xì)胞培養(yǎng)ST細(xì)胞接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞48小時ST細(xì)胞接種偽狂犬病毒病變過程照片Marc-145細(xì)胞接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞38小時接種細(xì)胞50小時Marc-145細(xì)胞接種PRRSV病毒病變過程照片PK-15細(xì)胞接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞36小時接種細(xì)胞48小時PK-15細(xì)胞接種TGEV病毒病變過程照片MDCK細(xì)胞接種細(xì)胞24小時接種細(xì)胞48小時接種細(xì)胞72小時MDCK細(xì)胞接種H9N2病毒病變過程照片細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用病毒生物學(xué)定量病毒克隆化——獲得遺傳均一的病毒方便地生產(chǎn)病毒同步化研究病毒復(fù)制的過程，提高實驗的可重復(fù)性

病毒的定量并非所有的病毒顆粒都有感染活性有感染活性的病毒顆粒一般僅占總數(shù)的幾百到幾萬分之一病毒的定量病毒的定量分為：物理顆粒的數(shù)量有感染活性的顆粒的數(shù)量有感染活性的顆粒的數(shù)量，更有生物學(xué)意義特稱為或Titre)病毒的效價(TiterTitre病毒效價的測定（之一）空斑測試（plaqueassay）用稀釋的病毒液感染單層細(xì)胞，蓋上瓊脂，限制病毒的流動病毒感染造成局部細(xì)胞死亡或病變，形成肉眼可見的“斑”或“空斑”（噬菌體中：噬菌斑）根據(jù)“斑”的數(shù)量和稀釋倍數(shù)可以統(tǒng)計病毒的效價病毒空斑未感染的細(xì)胞被染成紅色病毒空斑顯微鏡下的空斑帶有LacZ基因的重組病毒形成的空斑病毒效價的測定（多孔板終點(diǎn)稀釋法）病毒逐級稀釋接入長有細(xì)胞的孔中，培養(yǎng)后觀察各孔中細(xì)胞是否被感染，計算TCID50（TissueCulture50%InfectionDose——一半的孔被感染時的稀釋度）病毒效價的相對性用不同的細(xì)胞株去測定病毒的效價，可能會得到完全不同的效價數(shù)據(jù)需要標(biāo)準(zhǔn)化病毒感染復(fù)數(shù)(MultiplicityofInfection,MOI)病毒感染復(fù)數(shù)：病毒感染細(xì)胞時平均每個細(xì)胞的病毒數(shù)1萬個細(xì)胞，為了保證99%細(xì)胞感染病毒，至少有一個病毒感染，共需要多少病毒？病毒感染細(xì)胞是隨機(jī)的獨(dú)立事件?群體感染時，有的細(xì)胞被1個病毒粒子感染，有的被2個病毒粒子感染……有的可能沒有被病毒感染?病毒感染細(xì)胞的情況，符合泊松分布：p(k)=e-mmk/k!(其中m：病毒感染復(fù)數(shù)，p(k)：細(xì)胞被k個病毒感染的幾率)所以：未被感染的細(xì)胞的比率：p(0)=e-m被1個病毒感染的細(xì)胞比率：p(1)=e-mm被2個病毒感染的細(xì)胞比率：p(2)=e-mm2/2問題：pfu與TCID50間的換算關(guān)系是：1TCID50=0.7pfu為什么？感染復(fù)數(shù)對病毒感染的實驗結(jié)果有很大影響低感染復(fù)數(shù)時感染不同步高感染復(fù)數(shù)時病毒易產(chǎn)生變異?不同的實驗要求不同的感染復(fù)數(shù)2、活體培養(yǎng)方法仍有許多病毒缺乏可供其復(fù)制的離體細(xì)胞培養(yǎng)系