《生物化學簡明教程》第四版 第二章蛋白質

第2章

蛋白質(Protein)

蛋白質的分類蛋白質的組成單位氨基酸肽蛋白質的結構蛋白質結構與功能的關系蛋白質的性質與分離、分析技術內容提要是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構象和一定生物功能的生物大分子。纖維狀球狀蛋白質(Protein)蛋白質的生物學作用◆蛋白質是生物體的重要組成成分◆蛋白質具有重要的生物學功能1）作為生物催化劑（酶）2）物質的轉運和儲存3）運動與支持作用4）免疫保護作用5）代謝調節(jié)作用6）參與細胞間信息傳遞◆氧化供能◆蛋白質是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達80％。2.1.1依據(jù)蛋白質的形狀分類

1）球狀蛋白質：（globularprotein）外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結晶，大多數(shù)蛋白質屬于這一類。2）纖維狀蛋白質(fibrousprotein)分子構象類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質和不溶性纖維狀蛋白質。3）膜蛋白質

2.1蛋白質的分類2.1.2依據(jù)蛋白質的組成分類

1.簡單蛋白(simpleprotein)：又稱為單純蛋白質；這類蛋白質只含由

-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。（3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。（4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。（1）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。（2）糖蛋白與蛋白聚糖：由簡單蛋白與糖類物質組成。如細胞膜中的糖蛋白等。糖與蛋白質的結合方式：O連接和N連接（3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。如血清

-，

-脂蛋白等。（4）色蛋白：由簡單蛋白與色素結合而成。如血紅素、過氧化氫酶、細胞色素c等。（5）磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。2.結合蛋白(conjugatedprotein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成2.1.3按功能分類

酶調節(jié)蛋白貯存蛋白轉運蛋白質運動蛋白防御蛋白和毒蛋白受體蛋白支架蛋白結構蛋白異常功能2.2蛋白質的組成單位氨基酸氨基酸（aminoacid)

是蛋白質的基本組成單位。從細菌到人類，所有蛋白質都由20種標準氨基酸組成。2.2.1氨基酸的結構通式不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR

+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式氨基酸的結構式書寫20種常見氨基酸的名稱和結構式甘氨酸(a-氨基乙酸)Glycine丙氨酸(a-氨基丙酸)Alanine

亮氨酸(γ-甲基-a-氨基戊酸)*Leucine

異亮氨酸(β-甲基-a-氨基戊酸)*Isoleucine纈氨酸(b-甲基-a-氨基丁酸)*Valine脯氨酸(a-四氫吡咯甲酸)Proline苯丙氨酸(b-苯基-a-氨基丙酸)*Phenylalanine蛋(甲硫)氨酸(a-氨基-γ-甲硫基戊酸)*Methionine

色氨酸[a-氨基-β-(3-吲哚基)丙酸]*Tryptophan絲氨酸(a-氨基-β-羥基丙酸)Serine谷氨酰胺(a-氨基戊酰胺酸)Glutamine天冬酰胺(a-氨基丁酰胺酸)Asparagine蘇氨酸(a-氨基-b-羥基丁酸)*Threonine半胱氨酸(a-氨基-b-巰基丙酸)Cysteine酪氨酸(a-氨基-β-對羥苯基丙酸)Tyrosine天冬氨酸(a-氨基丁二酸)Asparticacid谷氨酸(a-氨基戊二酸)Glutamicacid賴氨酸(a,w-二氨基己酸)*Lysine精氨酸(a-氨基-d-胍基戊酸)Arginine組氨酸[a-氨基-b-(4-咪唑基)丙酸]Histidine20種標準氨基酸蛋白質的元素組成：C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等蛋白質氮占生物組織中所有含氮物質的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量蛋白質含量＝蛋白氮×6.256.25

—16％的倒數(shù)，每測定１g氮相當于6.25g的蛋白質。也就是1g氮所代表的蛋白質量（克數(shù)）蛋白質含量的測定（自學）

凱氏定氮法(測定氮的經典方法)優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法也簡單；缺點：易將無機氮(如核酸中的氮)都歸入蛋白質中,不精確。除了上法外，還有雙縮脲法，F(xiàn)olin—酚，考馬斯亮蘭G—250比色法等總結從蛋白質水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結構上的共同特點為：(1)與羧基相鄰的α-碳原子上都有一個氨基，因而稱為α-氨基酸(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性，[左旋（-）或右旋（+）]B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構體。目前已知的天然蛋白質中氨基酸都為L-型。2.2.2氨基酸的分類1.根據(jù)R的化學結構（1）脂肪族氨基酸：

1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；

2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro2.根據(jù)R的極性（1）極性氨基酸：1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；

2）帶正電：His、Lys、Arg；

3）帶負電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：

Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp總結屬于芳香族氨基酸的是：

色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe屬于亞氨基酸的是：

脯氨酸Pro含硫氨基酸包括：

半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly能形成二硫鍵的氨基酸是:半胱氨酸Cys含二羧基一氨基的氨基酸有:

谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH幾種特殊氨基酸這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的幾種特殊氨基酸2.2.3氨基酸的重要理化性質

一般物理性質:☆氨基酸一般有味（無味、甜、苦、鮮等）☆一般均溶于水，溶于酸、堿中；不溶于有機溶劑?！罡呷埸c（200℃以上）☆氨基酸的旋光性及立體異構

除甘氨酸外，氨基酸含有一個手性

-碳原子，因此都具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]，比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)?！畎被岬墓馕諛嫵傻鞍踪|的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，苯丙氨酸的max＝257nm，色氨酸的max＝280nm。

氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質子的—NH3+正離子和能接受質子的—COO-負離子，為兩性電解質。(1)兩性解離和等電點調節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（當氨基酸相互連接成蛋白質時，只有其側鏈基團和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。）氨基酸等電點的確定：1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據(jù)pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側pK值的算術平均數(shù)。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32推導過程pI=1/2(pKl′+pK2′)推導過程

對多氨基和多羧基氨基酸的解離解離原則：注意推導過程舉列：計算丙氨酸的等電點

N+H3N+H3

OH-

[Ala][H+]H3CCCOOHH3CCCOO-+H+K’1=

[Ala+]HHAla+Ala

N+H3NH2OH-

[Ala-][H+]H3CCCOO-H3CCCOO-+H+K’2=[Ala]HHAla

Ala-

結論中性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為α—氨基的解離常數(shù)。pI=(pK1，+pK2，)/2酸性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為側鏈羧基的解離常數(shù)。

pI=(pK1，+pK2，)/2堿性氨基酸：pK2，為α—氨基的解離常數(shù)，pK3，為側鏈氨基的解離常數(shù)。pI=(pK2，+pK3，)/2應用pH>pIaa“-”aa向正極移動pH<pIaa“+”aa向負極移動pH=pIaa“0”aa不移動溶液的pH偏離pI越遠，氨基酸帶凈電荷越多，在電場中越容易分離。利用不同的氨基酸在同一pH下所帶電荷不同而分離，如用陰離子交換樹脂柱層析分離氨基酸。等電點時,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。自測丙氨酸Ala的pI＝6.02，在pH＝7時，在電場中向（?）極移動。(2)氨基酸的化學性質

氨基酸在溶液狀態(tài)時,存在的平衡1）與茚三酮的反應氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。脯氨酸與茚三酮反應的產物：N+黃色化合物反應要點與應用

A.該反應由-NH2與-COOH共同參與B.茚三酮是強氧化劑C.用于氨基酸的定性、定量分析該反應非常靈敏，可在λ＝570nm測定吸光值測定范圍：0.5~50μg/mlD.脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質（不釋放NH3）2）與甲醛的反應：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2A.為α-NH2的反應B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反應，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應用

◆氨基酸定量分析氨基酸的甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當指示劑。B.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）◆簡單快速，一般用于測定蛋白質的水解或合成的速度..3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應NO2FO2N+HN2—CH—COOHRNO2O2NHN2—CH—COOHR

+HF弱堿性DNP-氨基酸（黃色）A.為α-NH2的反應B.氨基酸α-NH2的一個H原子，在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成黃色的2,4—二硝基苯基氨基酸（DNP—氨基酸，穩(wěn)定）應用鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸此反應首先由Sanger應用測定蛋白質中氨基酸的排序，確定了胰島素的一級結構5—二甲氨基萘磺酰氯（DNS—Cl，又稱丹磺酰氯）可以代替DNFB試劑測定蛋白質的N端氨基酸肽鏈氨基末端殘基的檢測（Sanger法）

黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進行鑒定H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl，為熒光試劑）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸二甲氨基萘磺酰氯的簡稱丹磺酰氯可以取代DNFB測定蛋白質N端氨基酸，靈敏度高

與5-二甲氨基萘磺酰氯的反應（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF重復測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設計出“多肽順序自動分析儀”反應特點及應用為α-NH2的反應由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又稱Edman降解法,此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。5）與亞硝酸的反應NH2—CH—COOH+HNO2R-CH-COOH+N2ROH+H2O應用：在標準條件下測定生成氮氣的體積，可計算氨基酸的量，稱為范斯萊克法。

6）與熒光胺反應

◆氨基酸與熒光胺反應生成具有熒光的產物，是α-NH2的反應◆用于氨基酸定量分析

根據(jù)熒光強度測定氨基酸含量（ng級）（激發(fā)波長λx=390nm，發(fā)射波長λm=475nm）。熒光胺H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸(λ412nm)應用:-SH的反應,測定樣品中游離-SH的含量7）與5,5′-雙硫基-雙（2-)硝基苯甲酸反應2.3肽2.3.1肽的結構一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物稱為肽。

氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）。

多肽（鏈）：多個氨基酸殘基之間以肽鍵連接起來的鏈狀化合物叫多肽或多肽鏈。氨基酸殘基：N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有方向性：

Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端肽鏈寫法：肽鍵的特點肽鍵平面——由于肽鍵具有部分雙鍵的性質，使參與肽鍵構成的六個原子（C

1、C、O、N、H、C

2）被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。

生物活性肽（biologicalactivepeptide,BAP）

是能夠調節(jié)生物機體的生命活動或具有某些生理活性的寡肽和多肽的總稱。

2.3.2生物活性肽的功能

（1）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCOCH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG

—◆分子中具有一個由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的

-氨基脫水縮合的-肽鍵

◆含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內重要的還原劑，保護某些蛋白質或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。

谷光甘肽的作用GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+氧化型谷胱甘肽舉例（2）催產素和升壓素

（3）促腎上腺皮質激素（ACTH）

39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段：

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（4）腦肽腦啡肽具有強烈的鎮(zhèn)痛作用（強于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。（5）胰高血糖素由胰島α-細胞分泌（β-細胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調節(jié)維持血糖濃度。（6）胃腸道活性肽2.4蛋白質的結構

蛋白質是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列,在蛋白質中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構象,conformation）。在結構中，這種構象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。2.4.1蛋白質的一級結構（化學結構）

蛋白質的一級結構指蛋白質多肽鏈中AA的序列，也包括二硫鍵的位置。

在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。

一級結構中包含的共價鍵主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學結構—S————S——2.4.2蛋白質的空間結構（構象、高級結構）——構象是蛋白質分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。研究蛋白質構象的方法

一．X射線衍射法：二．研究溶液中蛋白質構象的光譜方法：1．紫外差光譜2．熒光和熒光偏振3．圓二色性4．核磁共振（NMR）共價鍵次級鍵化學鍵肽鍵一級結構氫鍵二硫鍵二、三、四級結構疏水作用鹽鍵范德華力三、四級結構3.穩(wěn)定蛋白質空間結構的作用力（2）蛋白質的二級結構蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象

。主要的化學鍵：

氫鍵蛋白質二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1951年提出是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構象

結構特征

⑴螺旋的每圈有3.6個氨基酸殘基，每個氨基酸殘基的高度為0.15nm，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉100°，螺旋直徑0.6nm。（2）每個肽鍵的羰基氧與遠在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵，氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內氫鍵的形成。（要點：單鏈，右旋，一圈3.6殘基，上升0.54nm維系力：氫鍵，且全部平行，R－基指向外側）結構特征螺旋的帽化α-螺旋（α-helix）結構特點—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613螺旋

(ns)此外還有：310，4.416(3)R側鏈基團伸向螺旋的外側。RRRRRRRRR螺旋的橫截面(4）絕大多數(shù)天然蛋白質中的

-螺旋幾乎都是右手螺旋。結構特征：影響α-螺旋形成的因素在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，α-螺旋就不穩(wěn)定。（Lys、Glu）在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，α-螺旋就被中斷，產生一個彎曲（bend）或結節(jié)。Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋。2）β-折疊結構（β-pleatedsheet）

-折疊或

-折疊片，也稱

-結構或

-構象。

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構象。

-折疊結構幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直.氨基酸側鏈伸展在折疊片的上面和下面

-折疊有兩種類型：一種為平行式，另一種為反平行式N端在同一端。氨基酸殘基的長度0.325nmN端不在同一端。氨基酸殘基的長度0.347nm絲心蛋白的構象絲心蛋白的性能絲心蛋白具有抗張強度高，質地柔軟的特性。具有0.7nm的周期。絲心蛋白(fibroin)是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質。絲心蛋白的構象

絲心蛋白是典型的反平行β折疊片，多肽鏈取鋸齒狀折疊構象。側鏈交替地分布在折疊片的兩側。反平行β折疊片以平行的方式堆積成多層結構。鏈間主要氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHO特點：◆肽鏈回折180度,在

-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成;(常見氨基酸：Pro,Gly)◆以主鏈間氫鍵維持穩(wěn)定。彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構?！暨@類結構主要存在于球狀蛋白分子中。3）-轉角（β-turn）4）β凸起（β-bugle）在某些反平行的β片層中，有一股β折疊中有一個殘基的肽鍵沒有參與和相鄰的β折疊間的氫鍵，致使這一部位有所凸起，這一現(xiàn)象被稱為β凸起(βbulge)。插入的氨基酸殘基4）β凸起（β-bugle）是一種小片的非重復性結構，能單獨存在，但大多數(shù)經常作為反平行β折疊片中的一種不規(guī)則情況而存在。β凸起可認為是β折疊股中額外插入的一個殘基，它使得在兩個正常氫鍵之間、在凸起折疊股上是兩個殘基，而另一側的正常股上是一個殘基。5）無規(guī)卷曲或自由回轉(randomcoil)◆指無規(guī)律的松散肽鏈結構◆在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質肽鏈從整體上形成球狀構象?！魶]有一定規(guī)律的松散肽鏈結構。常常是酶的活性部位。（3）超二級結構和結構域超二級結構(super-secondarystructures)

:是指若干相鄰的二級結構中的構象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。是蛋白質二級結構至三級結構層次的一種過渡態(tài)構象層次。超二級結構的基本類型：

、、、

X

超二級結構的基本類型：模體在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體(motif)。鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構結構域(domain)◆是球狀蛋白質的折疊單位。多肽鏈在超二級結構的基礎上進一步繞曲折疊成緊密的近似球形的結構，具有部分生物功能?！魧τ谳^大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個以上結構域締合而成三級結構。◆類型：α-螺旋域；β-折疊域；α+β域；α/β域；無規(guī)則卷曲+β-回折域；無規(guī)則卷曲+α-螺旋結構域等（4）蛋白質的三級結構多肽鏈在二級結構、超二級結構和結構域的基礎上，主鏈構象和側鏈構象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結構。是多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側鏈）在三維空間的分布。疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學鍵：三級結構的特征

含多種二級結構單元，如α螺旋、β折疊等；

有明顯的折疊層次；

是緊密的球狀或橢球狀實體；

分子表面有一空穴(活性部位)；

疏水側鏈埋藏在分子內部，

親水側鏈暴露在分子表面。

主要由疏水作用力維持實例：肌紅蛋白抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結構肌紅蛋白的結構與功能

（1）功能：哺乳動物肌肉中儲存氧并運輸氧的蛋白。（2）肌紅蛋白的結構特點：

a.一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17800道爾頓。

b.肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結構，肽鏈共折疊成8段長度不等的-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。

c.具有極性側鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側鏈的氨基酸殘基多分布于分子內部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。輔基血紅素

Fe原子被稱為原卟啉IX（9）的有機分子固定的，共稱血紅素（Heme），使血液呈紅色。Fe有六個配位鍵，其中四個與卟啉的吡咯環(huán)的N原子相連。Fe2+稱亞鐵血紅素，F(xiàn)e3+為高鐵血紅素，只有Fe2+的蛋白才能結合氧肌紅蛋白的結構氧與肌紅蛋白的結合—Fe2+與珠蛋白的93位（F8）His的咪唑基N相連；—當形成氧合肌紅蛋白（oxy-myoglobin）時，第6個配位鍵與氧結合；—當成高鐵肌紅蛋白時，第6配位鍵被H2O分子占據(jù)；—在氧結合一側有一E7His氧結合部位形成空間位阻區(qū)肌紅蛋白的結構（5）蛋白質的四級結構◆四級結構是指由兩個或兩個以上具有三級結構的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構象的蛋白質分子。其中每條多肽鏈稱為亞基(subunit)?！裢ǔ喕挥幸粭l多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，亞基單獨存在時無生物學活性。當亞基聚合成為具有完整四級結構的蛋白質后，才有功能?！駚喕g的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵?！褚话銇碚f具有四級結構的蛋白屬于寡聚蛋白。血紅蛋白的結構

Hb分子近似球形；M.W.=65000

Hb由四個亞基組成（二條α亞基和二條β亞基）；

α亞基（141aa）比β亞基（146aa）短，但都比肌紅蛋白鏈（153aa）短；這主要是因為末端H螺旋比較短；

4個血紅素分別位于四條多肽鏈的E和F螺旋之間的裂隙處，并暴露于分子表面。

Hb-α和Hb-β及Mb雖然三級結構相似，但其氨基酸序列卻有很大的不同，約只有27個位置是相同的。四級締合在結構和功能上的優(yōu)越性1、降低比表面積，增加蛋白質的穩(wěn)定性2、豐富蛋白質的結構，以行使更復雜的功能。3、提高基因編碼的效率和經濟性。4、使酶的催化基團匯集，提高催化效率。5、形成一定的幾何形狀，如細菌鞭毛。6、適當降低溶液滲透壓。7、具有協(xié)同效應和別構效應，實現(xiàn)對酶活性的調節(jié)蛋白質的一級結構是它的氨基酸序列蛋白質的二級結構是由氫鍵導致的肽鏈卷曲與折疊Primary

structureSecondary

structure總結蛋白質的三級結構是多肽鏈自然形成的三維結構蛋白質的四級結構是亞基的空間排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure總結一個天然蛋白質在一定條件下，往往只有一種或很少幾種構象。用一個蛋白質中各個原子范德華體積的總和，除以蛋白質所占體積即得裝配密度，一般0.73~0.77.2.5蛋白質結構與功能的關系蛋白質分子具有多樣的生物學功能，需要一定的化學結構，還需要一定的空間構象。2.5.1蛋白質一級結構與功能的關系1.種屬差異蛋白質一級結構的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質結構上的差異，可以斷定它們在親緣關系上的遠近。舉例——胰島素，細胞色素C

不同生物和人的細胞色素c中氨基酸組成的差異生物名稱不同氨基酸數(shù)生物名稱不同氨基酸數(shù)黑猩猩0恒河猴1豬、牛、羊10馬12雞13海龜15金槍魚21小蠅25小麥35酵母44從細胞色素c的一級結構看生物進化物種進化過程中越接近的生物，細胞色素的一級結構越相似一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象以及功能也相似。

從細胞色素C的一級結構看生物進化2.分子病A、分子病的概念：由于遺傳基因的突變導致蛋白質分子結構的改變或某種蛋白質缺乏引起的疾病。B、例如：鐮刀性貧血病N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)結論蛋白質的一級結構決定它的空間結構，而特定的空間結構是蛋白質具有生物活性的保證2.5.2蛋白質構象與功能的關系別構效應：又稱變構效應，是指寡聚蛋白與配基結合，改變蛋白質構象，導致蛋白質生物活性改變的現(xiàn)象.例：血紅蛋白的別構效應免疫球蛋白蛋白質構象改變與疾病蛋白質構象疾?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。2.6蛋白質的性質與分離、分析技術2.6.1蛋白質的性質（1）蛋白質相對分子量：在10000~1000000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。超離心法（Svedberg于1940年設計）：蛋白質顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s）

x=蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白質分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數(shù)（蛋白質分子量很大，離心機轉速很快，則忽略不計）V——蛋白質的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)凝膠過濾法：分子量對數(shù)對洗脫體積作圖，并用標準分子量蛋白質作對照，從圖中就可以查得未知蛋白質的分子量。SDS電泳法：為什么可用SDS電泳來測定蛋白質的分子量？

SDS的加入→使蛋白質變性→兩者結合（1g蛋白質結合1.4gSDS）→使之復合物帶大量負電荷，遠遠掩蓋了蛋白質本身所帶電荷量和種類，因此在電場中由于與SDS結合全部帶負電荷，因此遷移速率只與分子量有關，以分子量對遷移率作圖成線性關系，以標準分子量蛋白質作對照，通過遷移率查得分子量。凝膠過濾法

凝膠過濾所用介質為凝膠珠，其內部為多孔網狀結構一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex測得幾種標準蛋白質的洗脫體積〔Ve〕以相對分子質量對數(shù)（logM）對Ve作圖，得標準曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標準曲線上可查出樣品蛋白質的相對分子質量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質電泳的泳動速率取決于荷質比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質變性（肽鏈伸展）并與SDS結合，形成SDS-蛋白質復合物不同蛋白質分子的均帶負電（SDS帶負電）；且荷質比相同（蛋白質分子大，結合SDS多；分子小，結合SDS少）不同蛋白質分子具有相似的構象用幾種標準蛋白質相對分子質量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖測出待測樣品的遷移率從標準曲線上查出樣品的相對分子質量電泳電泳電泳migration優(yōu)點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品缺點：誤差大，約為±10％（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質量蛋白質相對分子量最低分子量法：

若某一蛋白質中某一特定成分含量為x%，且該組分只有一份，則最低分子量=原子量（分子量）

100/x

蛋白質或多肽鏈中aa殘基的平均分子量為110,用蛋白質分子量除以110，可粗略估計出其aa殘基數(shù)，在解題時常常遇到這一常數(shù)。

（2）蛋白質的兩性電離及等電點蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

調節(jié)溶液的pH，使蛋白質所帶的正、負電荷相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時可以分開。1.自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。電泳（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。+

—2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。-+等電聚焦電泳：當?shù)鞍踪|在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－（3）蛋白質的變性(denaturation)

概念：在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。變性的本質：破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。變性蛋白質的特點①失去生物活性②溶解度減?、壅扯燃哟?，結晶能力減弱④容易被酶水解消化變性的分類：可逆變性：例如，把經過短時間煮沸的胰蛋白酶冷卻，可以恢復天然胰蛋白酶的性質(如結晶性、活性等)。不可逆變性：例如，煮熟的雞蛋變性應用變性在醫(yī)學上有很重要意義。臨床上常用高溫、紫外線、酒精等物理或化學方法使細菌或病毒的蛋白質變性而失去致病及繁殖能力。在實踐中，也有許多為提高某些生物制品的活性，要防止蛋白質的變性，如制取抗血清、疫苗等。蛋白質的凝固作用

(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

（4）蛋白質的膠體性質蛋白質分子的顆粒直徑已達1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。布朗運動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。++++++透析由于蛋白質分子體積很大,不能透過半透膜,而小分子物質能透過半透膜,這樣可把蛋白質分子與小分子物質分開,這個過程叫透析.+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉（5）蛋白質的沉淀反應1.中性鹽沉淀反應：加鹽使蛋白質沉淀析出鹽析稀鹽可使蛋白質表面同性電荷增加，增加蛋白質分子間的排斥,同時與水分子間的作用增強,而增加溶解性—鹽溶作用；高鹽破壞水膜、中和電荷,蛋白質聚集沉淀—鹽析,不同蛋白質鹽析的鹽濃度不同,故用不同鹽濃度分級沉淀蛋白質,分離的蛋白質不變性。分段鹽析：調節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。方法2.有機溶劑沉淀反應

用與水互溶的乙醇、丙酮等奪取水膜,等電點時加入更易沉淀,不同蛋白質所需溶劑濃度不同分級沉淀,但易引起變性，與有機溶劑濃度、作用時間和沉淀溫度有關條件：低溫（0~4。C），PH=PI3.重金屬鹽沉淀反應

蛋白質在pH＞pI時為負離子,可與Cu2+/Hg2+/Ag+/Pb2+等結合為不溶性蛋白鹽而沉淀4.加某些酸類的沉淀反應

蛋白質在pH<pI時帶正電荷,可與苦味酸、磷鎢酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等結合沉淀苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸、單寧酸、能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。

可逆沉淀(1)在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。(2)在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。

不可逆沉淀(1)在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強酸、堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的蛋白質或氨基酸雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質米倫反應HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(Hopking-Cole反應)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(Sakaguchi反應)α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(Folin-Cioculteu反應)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

（6）蛋白質的顏色反應—OHN（7）蛋白質的含量測定1)考馬斯亮藍G-250法2）紫外吸收法3）凱氏定氮法4)其它方法蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。2.6.2蛋白質的分離和分析技術（1）根據(jù)蛋白質溶解度不同進行分離