小鼠肝臟的解剖及肝切除術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

小鼠肝臟的解剖及肝切除術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究

在從牙齒上切除肝臟后，它具有強(qiáng)大的再生能力，通常為7.10天。1931年Higgins和Anderson首次創(chuàng)建大鼠70%肝部分切除模型,隨后這一模型被廣泛應(yīng)用于肝再生、肝腫瘤、肝衰竭、肝臟移植等相關(guān)基礎(chǔ)研究。隨著減體積肝移植、活體肝移植、雙或多供體肝移植、肝段移植等新技術(shù)正越來越多地應(yīng)用于臨床,基礎(chǔ)研究不僅對肝部分切除模型的制作提出了更高的要求,而且模型動物也越來越多樣化。已有報(bào)道在轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠中建立肝再生模型,使肝再生的分子生物學(xué)機(jī)制研究獲得了突破性進(jìn)展。然而,眾多學(xué)者直接將大鼠70%的肝部分切除技術(shù)運(yùn)用于小鼠中,造成不同實(shí)驗(yàn)室之間較大的結(jié)果差異。由于大、小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的分葉特性,小鼠的肝臟解剖及肝葉比例是否完全等同于大鼠目前并無相關(guān)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)對60只成年C57BL/6J小鼠肝臟進(jìn)行解剖學(xué)觀測并施行常用的70%和90%肝部分切除術(shù),旨在為小鼠肝切除模型的建立提供解剖基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為基于此模型的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。材料和方法一、飼養(yǎng)環(huán)境及電子外科健康成年C57BL/6J小鼠60只(中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供),年齡11~12周,體質(zhì)量25~28g,雌雄各半,隨機(jī)分為A組、B組和C組,各20只,雌雄分籠飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境(SPF級)中,溫度控制在(22.0±2.0)℃,自由進(jìn)水,標(biāo)準(zhǔn)鼠食喂養(yǎng),12h晝夜生活環(huán)境。顯微外科手術(shù)器械1套(可反復(fù)高壓消毒),自制泡沫塑料鼠板1個,腹腔小拉鉤3個,電子稱及電子天平(精確到0.0001g)各1個。各組手術(shù)操作均在SPF級環(huán)境中完成。二、不同肝葉比例的調(diào)查1.A組計(jì)算小鼠70%和90%的肝葉比例:取A組小鼠,術(shù)前不禁食、水,于手術(shù)當(dāng)日早晨8時分別稱取體質(zhì)量并記錄,3%水合氯醛按1.2ml/100g腹腔注射麻醉,麻醉滿意后將其固定在自制泡沫鼠板上,取腹正中切口,安爾碘消毒3遍,切口長約2cm,打開腹腔,用自制腹腔小拉鉤分別拉開左、右腹壁及向上拉開劍突,用棉簽浸濕生理鹽水后輕柔搏動肝臟,顯微剪游離肝周韌帶,快速切取整個肝臟,剔除肝表面外側(cè)的肝靜脈及肝上、肝后下腔靜脈和肝實(shí)質(zhì)外側(cè)的膽管、門靜脈、肝動脈及結(jié)締組織。用電子天平稱其濕重(體質(zhì)量),計(jì)算全肝(濕重)/體質(zhì)量比;分別稱量左外葉、中葉、右前葉、右后葉和尾狀葉體質(zhì)量,計(jì)算70%和90%的肝葉比例,為下一步手術(shù)提供依據(jù)。2.B組70%肝葉切除術(shù):取B組小鼠,開腹同前,根據(jù)先前計(jì)算結(jié)果,先用1-0手術(shù)絲線集束結(jié)扎左外側(cè)葉肝蒂,切除左外側(cè)葉(圖1所示第1步);然后依法結(jié)扎肝中葉肝蒂并切除(圖1所示第2步)。3.C組90%肝葉切除術(shù):C組小鼠在70%肝葉切除的基礎(chǔ)上,繼續(xù)結(jié)扎并切除肝右葉(圖1所示第3步)。B、C組用濕棉簽清除腹腔內(nèi)積液,確認(rèn)無活動性出血后用1-0手術(shù)絲線分兩層關(guān)腹。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng),觀察存活情況,記錄兩組手術(shù)成功率及術(shù)后1周動物生存率。三、體質(zhì)量或質(zhì)量生存率應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析結(jié)果,體質(zhì)量(或質(zhì)量)以ue003±s表示,生存率(%)=存活數(shù)/總數(shù)×100%。一、肝濕重、體質(zhì)量及全肝質(zhì)量比小鼠肝臟分葉結(jié)構(gòu)明顯,依據(jù)小鼠各葉獨(dú)立的脈管系統(tǒng),并參照人體肝臟分葉及命名方法,直觀、簡潔地將其分為5葉:左外側(cè)葉、中葉、右前葉、右后葉、尾狀葉(圖2),膽囊位于肝中葉。肝臟顏色紅潤,質(zhì)地柔軟,無明顯結(jié)節(jié)及脂肪樣變。每個肝葉有相對獨(dú)立的脈管系統(tǒng),其中右前及右后葉有一段融合共用的脈管系統(tǒng)。根據(jù)對20只成年C57BL/6J小鼠肝臟測量的結(jié)果,小鼠全肝濕重(質(zhì)量)為(1.325±0.029)g,體質(zhì)量為(26.500±1.140)g,全肝質(zhì)量/體質(zhì)量比為(4.92±0.13)%,肝左外側(cè)葉與中葉之和約占全肝比重的70%;左外側(cè)葉、中葉、右前葉與右后葉之和約占全肝比重的90%。每葉肝臟質(zhì)量及所占全肝比例見表1。二、術(shù)后手術(shù)成功率在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,B組小鼠完成70%肝臟部分切除的時間為(18.2±1.1)min,C組小鼠完成90%肝臟切除的時間為(26.7±1.5)min。本實(shí)驗(yàn)術(shù)中無結(jié)扎線脫落所致下腔靜脈、門靜脈或肝動脈出血,無膽瘺等。手術(shù)成功率為100%。B組和C組術(shù)后數(shù)小時內(nèi)均出現(xiàn)萎靡不振、毛發(fā)豎立,嗜睡狀態(tài),5~10h后恢復(fù)活動,可自由進(jìn)食、飲水。B組術(shù)后1周內(nèi)動物存活率為100%;C組術(shù)后1d內(nèi)的生存率為30%(6/20),2d存活率為0。C組死亡動物尸體解剖時腹腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有血凝塊、膿腫、腸瘺等。不同類型肝葉切除的效果分析小鼠和大鼠的肝臟解剖結(jié)構(gòu)不同之處在于小鼠肝臟有膽囊,大鼠則無該器官;相同之處為小鼠肝臟各葉同樣具有相對獨(dú)立的Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng),小鼠肝臟分為4個解剖功能單位:左外側(cè)葉、中葉、右葉(包括右前葉和右后葉)和尾狀葉。從A組小鼠肝臟的測量結(jié)果來看,各肝葉形態(tài)、大小比例相對恒定,使得單獨(dú)切除其中1個或數(shù)個肝臟功能單位變得簡單可行,而且切除肝葉比重相對恒定,保證了模型的規(guī)范性及有效性。肝切除對肝再生的刺激強(qiáng)度與所切除肝臟的質(zhì)量有直接的關(guān)系,70%和90%肝切除模型是實(shí)驗(yàn)中常用的兩種基礎(chǔ)模型。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,小鼠肝左外側(cè)葉與中葉之和約占全肝比重的70%(殘肝為右葉和尾狀葉);左外側(cè)葉、中葉、右前葉與右后葉之和約占90%(殘肝為尾狀葉),這一結(jié)果表明大、小鼠70%和90%肝切除的肝葉數(shù)目基本一致。理論上,如果切除左外側(cè)葉、中葉、右前葉及右后葉,只保留尾狀葉,那么殘肝質(zhì)量僅為全肝的7%左右;如選擇保留右前葉,殘肝質(zhì)量更接近于全肝的10%。但是,由于右前葉與右后葉同屬一個功能單位,兩者有一段融合共用的脈管系統(tǒng),單獨(dú)切除右后葉容易損傷殘留右前葉的脈管系統(tǒng)的通暢性,勢必會影響術(shù)后肝功能的恢復(fù),導(dǎo)致相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差,從而降低模型的有效性。我們體會,建立90%肝葉切除模型時,采取保留完整的尾狀葉更利于術(shù)后殘肝發(fā)揮功能。另一方面,本組模型所采用的直視下分步單純絲線結(jié)扎肝臟解剖功能單位后再切除肝葉的方法,不僅術(shù)中出血量極少,甚至無出血,而且與顯微鏡下肝部分切除術(shù)相比,更具有操作簡單,易于完成以及效率高等優(yōu)點(diǎn)。值得注意的是,切除肝中葉時,絲線結(jié)扎位置應(yīng)距離肝上下腔靜脈2~3mm遠(yuǎn)為宜,以保障術(shù)后下腔靜脈不會發(fā)生狹窄。此外,建模后如需計(jì)算再生肝臟質(zhì)量與體質(zhì)量比,應(yīng)剔除切肝時剩余肝葉殘樁部分肝組織后再計(jì)算。本組90%肝葉切除術(shù)后2d無動物存活,這與Gaub等所報(bào)道的大鼠90%肝葉切除后的生存率基本一致,但本組小鼠90%肝葉切除術(shù)后24h內(nèi)尚有30%的存活率,這為研究急性肝衰竭早期病理生理變化和治療提供了一個重要的窗口期。關(guān)于動物年齡、性別、術(shù)前禁食、手術(shù)時間、麻醉等實(shí)驗(yàn)相關(guān)問題,C57BL/6J作為動物實(shí)驗(yàn)中最常用的小鼠品系之一,選其作為模型動物,實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有參考價值。研究表明肝部分切除后肝再生過程中,幼年動物(4~6周)肝再生的速度比成年動物快,相反,40周以上的動物肝再生的速度明顯滯后。因此,肝再生模型宜選用8~14周齡的小鼠。同時盡可能使用同性別小鼠,因?yàn)槟承┻z傳基因的改變可能產(chǎn)生性別依賴的結(jié)果。很多研究者建立動物肝部分切除模型時,常對實(shí)驗(yàn)動物施行術(shù)前數(shù)小時的禁食、禁飲,事實(shí)上,禁食容易導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪樣變,極易影響術(shù)后的肝再生,長時間的禁飲可致小鼠體質(zhì)量明顯下降,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差增大。此外,肝臟代謝會隨著晝夜節(jié)律而改變,上午時段完成肝切除模型更可取。麻醉在完成動物模型中占有重要作用,麻醉劑選擇和使用不當(dāng)容易導(dǎo)致動物死亡,單用氣體麻醉劑需要特殊的輔助呼吸裝置,增加了實(shí)驗(yàn)難度,本研究中使用的水合氯醛及用法用量,不僅操作簡單,而且術(shù)中麻醉穩(wěn)定,術(shù)后蘇醒快,并不明顯增加動物死亡率,可作為此類手術(shù)的常規(guī)麻醉方法?？傊?我們采用直視下分步單純絲線結(jié)扎肝臟解剖功能單位后再切除肝葉的方法建立小鼠70%和90%肝部分切