實(shí)驗(yàn)四 微生物的菌落形態(tài)觀察、平板菌落計(jì)數(shù)及菌種保藏(張理珉)

實(shí)驗(yàn)四

微生物的菌落形態(tài)觀察、

平板菌落計(jì)數(shù)及菌種保藏目的要求1、觀察細(xì)菌、放線菌、霉菌的菌落形態(tài)特征，并加以區(qū)分。2、掌握平板菌落計(jì)數(shù)的原則和方法。3、掌握三種類群微生物的單菌落挑取，并接種于斜面，進(jìn)一步加強(qiáng)無菌操作技術(shù)。4、了解菌種保藏的原理、重要性及常見方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容微生物菌落形態(tài)觀察及區(qū)分（細(xì)菌、放線菌、霉菌、酵母菌——放在后面介紹）平板菌落計(jì)數(shù)（細(xì)菌、放線菌、霉菌）挑取單菌落接種于斜面介紹菌種保藏的原理和方法對于一個(gè)樣品，針對微生物來說最想了解的問題（首要問題）存在的微生物種類各類微生物的數(shù)量各類微生物的作用說明：

只是針對可人工培養(yǎng)的微生物來說，樂觀估計(jì)可人工培養(yǎng)的部分只占總數(shù)的10%（保守估計(jì)只有1%）；證據(jù)來源有兩方面——分子生物學(xué)的探索；和原位培養(yǎng)的比較。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一

——微生物菌落形態(tài)觀察及區(qū)分一、微生物的形態(tài)和菌落特征的比較表單細(xì)胞微生物菌絲狀微生物細(xì)菌酵母菌放線菌霉菌主要特征菌落含水狀態(tài)很濕或較濕較濕干燥或較干燥干燥外觀形態(tài)小而突起或大而平坦大而突起小而緊密大而疏松或大而致密細(xì)胞相互關(guān)系單個(gè)分散或有一定排列方式單個(gè)分散或假絲狀絲狀交織，緊密絲狀交織形態(tài)特征小而均勻，個(gè)別有芽孢大而分化細(xì)而均勻粗而分化參考特征菌落透明度透明或稍透明稍透明不透明不透明菌落與培養(yǎng)基結(jié)合程度不結(jié)合不結(jié)合牢固結(jié)合較牢因結(jié)合菌落顏色多樣單調(diào)，一般呈乳脂或礦燭色，少數(shù)紅色或黑色十分多樣十分多樣菌落正反面顏色的差別相同相同一般不同一般不同菌落邊緣一般看不到細(xì)胞可見球狀，卵圓狀或假絲狀細(xì)胞有時(shí)可見細(xì)絲狀細(xì)胞可見粗絲狀細(xì)胞細(xì)胞生長速度一般很快較快慢一般較快氣味一般有臭味多帶酒香味常有泥腥味或抗生素氣味往往有霉味二、細(xì)菌菌落形態(tài)的多樣性（示意圖）延展性較強(qiáng)的一些霉菌菌絲（松散）平板中菌落形態(tài)三、菌落特征描寫方法①大小大、中、小、針尖狀?？上葘⒄麄€(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)，或由教師指出一個(gè)大小范圍。②顏色黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。③干濕情況干燥、濕潤、粘稠④形態(tài)圓形、不規(guī)則等⑤高度扁平、隆起、凹下⑥透明程度透明、半透明、不透明⑦邊緣整齊、不整齊注意：可以進(jìn)一步細(xì)分描述菌落形態(tài)可因培養(yǎng)基成分不同而發(fā)生顯著變化（枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)缺乏時(shí)形成的雪花狀菌落）四、各類型菌落的總體特征

——反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)細(xì)菌——含水量高（多，形成毛細(xì)管水），濕潤，細(xì)膩（個(gè)體?。?/p>

細(xì)菌菌落說明：光滑型——一般具有莢膜；表面粗糙、褶皺、折光性強(qiáng)（不透明）菌落——一般具有芽孢；菌落大而扁平——一般具有鞭毛。放線菌——菌落大小差別不大，相對較小，干燥（粉狀），菌絲細(xì)（肉眼分不清楚）。霉菌——菌落較大，干燥（粉狀，較粗，顆粒），絲狀較粗（肉眼可以區(qū)分）。以最少的特征指標(biāo)完成區(qū)分或分類最好。細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括（群體形態(tài)特征）：①各種固體培養(yǎng)基上的形態(tài)（針對菌落）②各種液體培養(yǎng)基上的表現(xiàn)形態(tài)③各種斜面培養(yǎng)基上的表現(xiàn)形態(tài)（針對菌苔）④各種半固體培養(yǎng)基上的形態(tài)（穿刺培養(yǎng)）⑤其它注意：微生物菌落形態(tài)的區(qū)分除了通過肉眼進(jìn)行區(qū)分判斷外，還可以借助其它工具進(jìn)行直接接觸區(qū)分判斷（牙簽、接種工具等）細(xì)菌菌落掃描電鏡顯微照片實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二

——從分離平板上挑取單菌落挑取細(xì)菌單菌落接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上——接種環(huán)挑取放線菌單菌落接種于高氏1號培養(yǎng)基斜面上——接種環(huán)、接種鉤挑取霉菌單菌落接種于馬丁氏培養(yǎng)基斜面上——接種環(huán)、接種鉤一般流程圖（無菌操作）：

拿起平板并打開→用接種工具挑取單菌落→放于酒精燈外焰旁（不得過近？）→放下平板拿起斜面并取下塞子→用已粘有菌體的接種工具在斜面上劃“之”字線或直線→接種工具取出、灼燒→塞好膠塞→作標(biāo)記（菌種名稱、接種人、接種日期等）。接種斜面的演示圖操作要點(diǎn)：①始終保持無菌操作；②棉塞或硅膠塞不放于桌面，只能夾于拿接種工具的手中（小手指和手掌中間或無名指和小手指中間）；③一般在斜面培養(yǎng)基上以“之”線劃接種（充分利用斜面，得到最大量的菌體）；④有時(shí)也進(jìn)行直線接種劃線（斜面培養(yǎng)特征觀察）說明：注意試管斜面的拿法（手掌向上，斜面向上），與接種工具的配合使用；記號筆標(biāo)記時(shí)，過火烤一下，字不容易掉；挑取單菌落于相應(yīng)斜面，管口標(biāo)記學(xué)號，橡皮筋捆扎（三支）；三支斜面的接種情況作為一次考核，記入平時(shí)成績。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容三

——平板菌落計(jì)數(shù)一、相關(guān)知識介紹1、微生物增殖和樣品微生物數(shù)量的計(jì)量平板菌落計(jì)數(shù)

使單細(xì)胞形成菌落，一個(gè)單菌落代表一個(gè)單細(xì)胞，從而反映出微生物的數(shù)量。（1）利用計(jì)數(shù)器在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)（以后介紹）；（2）最大或然數(shù)（Mostprobablenumber，MPN，又稱稀釋培養(yǎng)測數(shù)法、最大可能數(shù)）；

適用具有特殊生理功能的類群——存在但不能人工培養(yǎng)形成單菌落，可以利用生化手段檢測出；利用統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算，結(jié)果粗放，只能得到數(shù)量級（近似數(shù)）。（3）菌體濁度的測定（只針對單細(xì)胞微生物）；

利用分光光度計(jì)在600nm測定吸光度值。（4）細(xì)胞干重和濕重的測定（有時(shí)濕重以體積計(jì)量）；（5）各種細(xì)胞物質(zhì)含量的測定（蛋白質(zhì)、核酸、ATP、磷、葉綠素等定量測定）——建立了多種快速檢測方法；說明：后兩種對絲狀菌比較有意義。2、常見微生物檢測項(xiàng)目（1）常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)（2）致病微生物項(xiàng)目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O-157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等3、快速檢測方法的現(xiàn)狀國外許多政府檢測機(jī)構(gòu)都在大量使用快速檢測方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色培養(yǎng)基法在國外應(yīng)用相當(dāng)成功。國內(nèi)的許多政府檢測機(jī)構(gòu)也都已經(jīng)在使用或正在考慮使用國外先進(jìn)的快速檢測技術(shù)。從長遠(yuǎn)發(fā)展趨勢來說，快速方法是微生物檢測的一大方向（？）。4、常規(guī)微生物快速檢測技術(shù)現(xiàn)狀傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法：（1）螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀＋菌落計(jì)數(shù)儀（2）濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測。（3）紙片法：培養(yǎng)基固體在載體上。省去制做培養(yǎng)基的時(shí)間。主要用于細(xì)菌總數(shù)檢測。（4）其它：如Simplate即用膠，改良MPN產(chǎn)品。螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀aColyte自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀螺旋平板原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動(dòng)同時(shí)自動(dòng)將樣品稀釋1000倍?？焖贆z測微生物數(shù)量的新方法：（1）ATP法（2）電化學(xué)法（3）顏色變化（4）流式細(xì)胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)（5）其它：熱量法，放射測量法說明：檢測方法建立的基礎(chǔ)——可測、穩(wěn)定、重現(xiàn)、可行、簡便濁度與微生物生物量測定原理：①細(xì)胞的存在會(huì)造成光的散射，降低光線的透過；②在一定范圍內(nèi)細(xì)胞濃度與吸光度成正比二、平板菌落計(jì)數(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：反映的是微生物活菌數(shù)量，可獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)（如活菌制劑），以及食品、飲料和水（包括水源水）等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。缺點(diǎn)：操作較繁，所需時(shí)間較長，測定結(jié)果易受多種因素的影響。三、平板菌落計(jì)數(shù)的表述及計(jì)算因?yàn)槲⑸锊灰淄耆稚⒊蓡蝹€(gè)細(xì)胞；菌落的來源也并非完全為單個(gè)細(xì)胞；因此其測定結(jié)果比實(shí)際菌數(shù)偏低；引入菌落形成單位（colony-formingunits，cfu）來表示，而不以絕對菌體數(shù)量來表示樣品的活菌含量。計(jì)算公式：計(jì)算公式說明：①如樣品來源為液體其表示為CFU/ml；②所加樣品量為每個(gè)平板所加入的相應(yīng)稀釋液的體積（ml）。四、菌落計(jì)數(shù)原則（六條）

1、先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無片狀菌苔生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)。

2、首先選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該樣品的細(xì)菌總數(shù)（見下表，例1）。

3、若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30～300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則取其中稀釋度(倍數(shù))較小的計(jì)算菌落總數(shù)（見下表，例2及例3）。

4、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度(倍數(shù))最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見下表，例4）。

5、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度(倍數(shù))最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見下表，例5）。

6、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則以最近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)（見下表，例6）。計(jì)算菌落總數(shù)方法舉例（加樣量為1mL）例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè)／mL）備注10-110-210-3１136516420－1.64×104一般采用科學(xué)計(jì)數(shù)法；取兩位小數(shù)；“無法計(jì)數(shù)”和“0”在這里是兩個(gè)概念——前者是指因稀釋倍數(shù)掌握不好或其它原因造成不能計(jì)數(shù)，后者指平板上無微生物菌落生長。２2760295461.63.78×104３2890271602.22.71×104４無法計(jì)數(shù)1650513－5.13×105５27115－2.70×102６無法計(jì)數(shù)30512－3.05×104針對計(jì)數(shù)原則的說明1、比較時(shí)要換算至同一個(gè)稀釋度進(jìn)行；2、霉菌可能難以完全遵循此六項(xiàng)計(jì)數(shù)原則，菌落大，漫延性強(qiáng)，30~300個(gè)/皿時(shí)，菌落過密重疊而無法計(jì)數(shù)。3、牛肉膏培養(yǎng)基：只計(jì)細(xì)菌的數(shù)量高氏1號培養(yǎng)基：只計(jì)放線菌的數(shù)量馬丁氏培養(yǎng)基：只計(jì)霉菌的數(shù)量五、平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)表細(xì)菌稀釋度10-310-410-5123平均123平均123平均cfu數(shù)/平板每毫升中的cfu數(shù)放線菌稀釋度10-210-310-4123平均123平均123平均cfu數(shù)/平板每毫升中的cfu數(shù)霉菌稀釋度10-210-310-4123平均123平均123平均cfu數(shù)/平板每毫升中的cfu數(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四

——介紹菌種保藏的原理和方法一、菌種保藏的重要性微生物基本特性所決定的——