中藥顯微鑒別技術(shù)講義3

第三部分顯微制片技術(shù)

在進(jìn)行顯微鑒別時(shí)，首先要將“檢樣”制成適于鏡檢的標(biāo)本。對(duì)于完整的藥材可制成各種切面的切片；對(duì)于粉末藥材(包括丸、散等成方)可直接裝片或作適當(dāng)處理后制片。

永久片制作技術(shù)臨時(shí)制片技術(shù)1、制片設(shè)備

滑走切片機(jī)——半自動(dòng)切片機(jī)脫水機(jī)

包埋機(jī)2變倍體視顯微鏡是一種具有立體感覺的顯微鏡。主要用途：

作為動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、昆蟲學(xué)、組織學(xué)、礦物學(xué)、考古學(xué)、地質(zhì)學(xué)和皮膚病學(xué)等的研究和解剖工具。電腦型連續(xù)變倍體視顯微鏡SZX-16研究用電腦（數(shù)碼相機(jī)）型連續(xù)變倍體視顯微鏡它觀察物體時(shí)能產(chǎn)生正立的三維空間像，立體感強(qiáng)，成像清晰和寬闊，具有較長的工作距離，，并可根據(jù)觀察物的特點(diǎn)選用不同的反射和透射光照明，是適用范圍非常廣泛的常規(guī)顯微鏡。對(duì)同一物體可實(shí)現(xiàn)連續(xù)放大倍率觀看,可能直接電視機(jī)或電腦上觀察實(shí)物圖像。目鏡鏡臂物鏡轉(zhuǎn)換器物鏡玻片移動(dòng)裝置載物臺(tái)聚光鏡光源鏡座3、透射光生物學(xué)顯微鏡數(shù)碼型透射光生物學(xué)顯微鏡123456784、偏光顯微鏡偏光顯微鏡偏光顯微鏡(polarizingmicroscope)

用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏振器），使進(jìn)入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中裝有另一偏振片（檢偏振器，一個(gè)偏振方向與起偏振器垂直的起偏器），這種顯微鏡的載物臺(tái)是可以旋轉(zhuǎn)的，當(dāng)載物臺(tái)上放入單折射的物質(zhì)時(shí)，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)，由于兩個(gè)偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時(shí)，由于光線通過這類物質(zhì)時(shí)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺(tái)便能檢測到這種物體。在偏光顯微鏡下，藥材的鑒別要素在色彩上表現(xiàn)出一定的變化，可作為大多數(shù)植物、動(dòng)物、礦物類藥材的顯微鑒別依據(jù)之一。如植物的淀粉在偏光顯微鏡下呈現(xiàn)黑十字現(xiàn)象，不同類型的淀粉其黑十字形象不同（圖2）；草酸鈣結(jié)晶類型多樣，在偏光顯微鏡下呈不同的多彩顏色（圖2）；石細(xì)胞在植物體內(nèi)廣泛分布，其細(xì)胞壁在偏光顯微鏡下呈亮黃色或亮橙黃色；纖維、導(dǎo)管在偏光顯微鏡下則呈強(qiáng)弱不同的色彩；動(dòng)物的骨碎片、肌纖維、結(jié)晶狀物、毛茸等也呈現(xiàn)出不同的偏光特性；礦物類物質(zhì)多具有偏光特性。偏光下的草酸鈣晶體與淀粉粒5、倒置生物學(xué)顯微鏡6、掃描電子顯微鏡掃描電鏡工作原理掃描電子顯微鏡（簡稱掃描電鏡）分辨率高，放大倍率5~100,000，能使物質(zhì)的圖像呈現(xiàn)顯著的表面立體結(jié)構(gòu)特征，樣品制備操作又較簡易。在藥材鑒定，特別在同科屬種間的表面結(jié)構(gòu)的鑒別比較上，已成為一種新的手段。如：掃描電子顯微鏡用于研究花粉粒、種皮和果皮的表面紋飾，莖、葉表皮組織的結(jié)構(gòu)(毛茸、腺體、氣孔、角質(zhì)層、蠟層、分泌物等)的細(xì)微特征，木類藥材的解剖以及動(dòng)物體壁、鱗片及毛等的鑒別。

小孢子囊及小孢子微形態(tài)差異十三種卷柏大孢子微形態(tài)差異使用顯微鏡的注意事項(xiàng)合理制片，蓋玻片上不得有試液殘留，避免污染物鏡及載物臺(tái)，損傷鏡頭。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，由低到高逐級(jí)變換、選用合適放大倍數(shù)的物鏡觀察。使用40倍物鏡時(shí)，可用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)焦距，禁止用粗螺旋調(diào)節(jié)；也不得移動(dòng)載玻片。根據(jù)觀察物象，選擇偏光條件確認(rèn)特征。用畢，應(yīng)將最小物鏡與通光孔相對(duì)，關(guān)閉光源，罩好，收置起來。顯微鏡的光學(xué)部分，只能用特殊的擦鏡頭紙擦拭。7、常用制片法

——永久片制作技術(shù)藥材切片標(biāo)本的制作方法較多。在藥材鑒定的研究工作中往往將其制成石蠟切片(永久切片)，因制成的石蠟切片外形較完整，厚薄均勻，且可制得連續(xù)切片，觀察時(shí)方便，又能長期保存。但由于制片技術(shù)較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)太多，不適用于日常檢驗(yàn)。常用制片法

——臨時(shí)制片技術(shù)徒手切片或滑走切片法：表面裝片：為觀察葉類、花類及全草類藥材的葉片、花冠、萼片、苞片等的表皮組織及其附屬物的特征。解離組織裝片：可清楚地觀察比較堅(jiān)硬的細(xì)胞組織，如導(dǎo)管、纖維、石細(xì)胞等的形態(tài)。花粉粒與孢子制片法：觀察花粉粒、孢子等的形態(tài)特征或構(gòu)造，需用花粉粒與孢子制片法制片。磨片法：觀察礦物藥或較堅(jiān)硬的動(dòng)物類藥材如珍珠、石決明及動(dòng)物骨骼，可采用磨片法制片。7.1

儀器和用具

儀器

生物學(xué)顯微鏡（最好具有2.5×或4×物鏡頭及偏光裝置）、顯微攝影裝置或顯微描繪器、電腦聯(lián)機(jī)裝置及其圖像處理軟件、滑走切片機(jī)、小型粉碎機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、醫(yī)用超聲儀等。

用具

放大鏡、刀片、鑷子、剪刀、解剖針

載玻片、蓋玻片7.1儀器和用具吸濕器（即玻璃干燥器改裝成底部放入蒸餾水加微量苯酚防霉，上部瓷板上置藥材樣品，利用潮氣潤濕藥材樣品）培養(yǎng)皿或小燒杯、酒精燈、試管，試管架、滴管、玻璃棒、乳缽、綢布、濾紙、火柴等。7.2試液——封藏劑7.2.l

水合氯醛試液為常用封藏液，也是透化劑?？墒垢煽s的細(xì)胞膨脹而透明，并能溶解淀粉粒、樹脂、蛋白質(zhì)、葉綠素及揮發(fā)油等，加熱后更為明顯。

7.2.2

甘油醋酸試液（斯氏液）為常用封藏液，專用于觀察淀粉形態(tài)，可使淀粉粒保持原形，便于測量其大小。

7.2.3

甘油-乙醇溶液封藏液，也是軟化劑。常用于保存植物性材料及臨時(shí)切片，有軟化組織的作用。3試液——染色劑7.2.4

蘇丹Ⅲ試液此液可使木栓化、角質(zhì)化細(xì)胞壁及脂肪油、揮發(fā)油、樹脂等染成紅色或淡紅色。

7.2.5

釕紅試液（臨用新制）此液可使粘液染成紅色。

7.2.6

間苯三酚試液此液與濃鹽酸合用，可使木化細(xì)胞壁染成紅色或紫紅色。

7.2.7

碘試液（臨用現(xiàn)配。應(yīng)置棕色瓶內(nèi)保存）此液可使淀粉染成藍(lán)色或紫色；蛋白質(zhì)或糊粉粒染成棕色或黃棕色。

7.2.8硝鉻酸試液此液為常用的“植物組織解離液”。各檢品的解離浸泡時(shí)間，按材料的質(zhì)地不同而異。7.2.9α-萘酚試液此液可使菊糖染成紫紅色，并很快溶解。

3.1l氯化鋅碘試液此液用于檢查木質(zhì)化與纖維素細(xì)胞壁，前者顯黃棕色，后者顯藍(lán)色或紫色。7.3

顯微標(biāo)本的制作7.3.1

橫切制片或縱切制片

7.3.1.1

藥材的預(yù)處理將應(yīng)觀察的部位、切成適當(dāng)大小的塊或段，一般以寬lcm、長3cm為宜，切面削平整。質(zhì)地軟硬適中的樣品可直接進(jìn)行切片；質(zhì)地堅(jiān)硬的則需先使其軟化后再切片。制片的預(yù)處理——軟化軟化方法可采用放在吸濕器中悶潤，或在水中浸軟或煮軟。經(jīng)軟化處理的材料，檢查軟化是否合適，可用刀片切割材料，若較容易切下薄片，則表示軟化適宜。有些根、根莖、莖及木類藥材，質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，可將削平的切面浸水中片刻，待表面潤濕時(shí)取出，直接切片也能切成較完整的薄片。過于柔軟的樣品，可將其浸入70%~95%乙醇中，約20分鐘后可變硬些，再切片。制片的預(yù)處理——禁忌藥材預(yù)處理時(shí)，應(yīng)注意不能影響要觀察的顯微鑒別特征。如要觀察菊糖、粘液等在軟化、切片、裝片等過程中，均不可與水接觸，以免溶解消失；要觀察揮發(fā)油、樹脂等，則不可與高濃度乙醇或其它有機(jī)溶媒接觸。如：茯苓淀粉粒菊糖7.3.1.2切片在檢驗(yàn)工作中，此法最常用，操作簡便，迅速，制成的切片保持其細(xì)胞內(nèi)含物的固有形態(tài)，便于進(jìn)行各種顯微化學(xué)反應(yīng)觀察1)

徒手切片法切片一手持刀片，另一手拇指和食指夾持樣品，中指托著樣品的底部，使樣品略高出食、拇二指；肘關(guān)節(jié)應(yīng)固定，使樣品的切面保持水平，刀口向內(nèi)并使刀刃自前向后切削，即可得薄切片。操作時(shí)，材料的切面和刀刃須經(jīng)常加水或50%乙醇保持濕潤，防止切片粘在刀片上。切好的切片用毛筆蘸水輕輕從刀片上推入盛有水或50％乙醇的培養(yǎng)皿中。2)滑走切片機(jī)切片此法不需要較高的技巧，只要了解掌握操作方法，短時(shí)間內(nèi)即可學(xué)會(huì)并切出較薄的切片，適用于切質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、形狀較大的藥材樣品，柔軟的樣品經(jīng)冷凍處理亦可切得較薄的切片。

切片前：應(yīng)檢查切片機(jī)是否穩(wěn)固，并調(diào)試刀具。將切片刀夾持在夾刀器上夾緊，調(diào)整刀的角度(約0。~15。)；調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器至所需厚度。把制備好的樣品用兩塊軟木夾住或直接放在切片機(jī)的材料固定器上夾緊夾正，使樣品露出軟木塊或固定器上端0.5cm，調(diào)整好樣品高度，使刀刃靠近樣品的切面且平行并略高于刀刃約0.5~1mm。切片時(shí)

用右手握夾刀器柄，往操作者方向迅速拉動(dòng)，切下的切片附著于刀的表面上，用毛筆蘸水把切片取下放于盛水的培養(yǎng)皿中。將刀推回原處，轉(zhuǎn)動(dòng)厚度推進(jìn)器，用毛筆蘸水潤濕材料切面及刀刃，再拉刀柄，往返推拉，可得到許多厚度均勻完整的切片。若切片不成功，應(yīng)檢查切片刀是否太鈍，則應(yīng)磨刀或換鋒銳的切片刀，若切得太薄而破碎，則逐漸增加厚度至能切得完整的薄片為度。注意：夾持在材料固定器上的樣品切面接近于固定器上端時(shí)，必須注意防止切片刀刃碰撞固定器而損毀切片刀。7.3.1.3

裝片選取薄而平整的切片置載玻片上，根據(jù)所要觀察的內(nèi)容要求，滴加適宜的試液1~2滴，蓋好蓋玻片，即可在顯微鏡下觀察。為防止較大的切片彎卷，可選取理想的切片，用兩張載玻片夾住，浸于水中放置4小時(shí)使材料壓平，放入95%乙醇中固定，甘油裝片觀察。透化在載玻片上放有切片處滴加1~2滴水合氯醛試液，置載玻片于酒精燈上方微微加熱，至邊緣起小泡即停止加熱，可繼續(xù)補(bǔ)充試液再加熱，以不燒干為度，直至切片透化完全為止。注意：加熱溫度不能過高，以防水合氯醛試液沸騰，使組織內(nèi)帶入氣泡；加熱時(shí)應(yīng)將載玻片不斷移動(dòng)，以免受熱不勻而炸裂。透化后放冷，加甘油乙醇試液l~2滴后加封蓋片，貼上標(biāo)簽。冬日室溫較低時(shí)，透化后不待放冷即滴加甘油乙醇液，以防水合氯醛結(jié)晶析出而妨礙觀察。水合氯醛試液能使已收縮的細(xì)胞膨脹，便于清楚地觀察組織構(gòu)造；可溶解淀粉粒、蛋白質(zhì)、葉綠體、樹脂、揮發(fā)油等，對(duì)草酸鈣結(jié)晶無作用，為觀察草酸鈣結(jié)晶的良好試劑。如需觀察菊糖等一些多糖物質(zhì)則加水合氯醛試液不加熱。7.3.2

粉末制片主要用于粉末狀的藥材及藥材粉末制成的成方制劑的觀察。

4.2.l藥材粉末制備取干燥藥材，磨或銼成細(xì)粉（通常應(yīng)過80目以上藥篩），裝瓶，貼上標(biāo)簽。制備粉末時(shí)，注意取樣的代表性。例如：根類藥材要切取根頭、根中段及根尾等部位，并全部磨粉，過4號(hào)篩，混合均勻，不得丟棄渣頭。干燥時(shí)，一般溫度不能超過60℃，避免淀粉粒糊化，有礙觀察。7.2.2

粉末制片用解剖針挑取樣品粉末少許，置載玻片的中央，加適宜的試液1滴，用針攪勻(如為酸或堿時(shí)應(yīng)用細(xì)玻棒代替針)，待液體滲入粉末后，用左手食指與拇指夾持蓋玻片的邊緣，使其左側(cè)與藥液層左側(cè)接觸，再用右手持小鑷子或解剖針托住蓋玻片的右側(cè)，輕輕下放，則液體逐漸擴(kuò)延充滿蓋玻片下方。如液體未充滿蓋玻片，應(yīng)從空隙相對(duì)邊緣滴加液體，以防產(chǎn)生氣泡；若液體過多，用濾紙片吸去溢出的液體，最后在載玻片的左端貼上標(biāo)簽或書寫上標(biāo)記。7.3.3顯微化學(xué)分析

丁香切片滴加3%氫氧化鈉的氯化鈉飽和液，油室內(nèi)有針狀丁香酚鈉結(jié)晶析出；北柴胡橫切片加無水乙醇-濃硫酸1：1液，木栓層、栓內(nèi)層和皮層顯黃綠色至藍(lán)綠色。7.3.4微量升華法

利用藥材所含成分有升華現(xiàn)象，置顯微鏡下觀察結(jié)晶形狀、色澤。如大黃，可見菱狀針狀或羽狀結(jié)晶。7.3.5

成方制劑粉末裝片

按劑型不同，分別處理樣品，按粉末制片法裝片觀察。1)散劑、膠囊劑可直接取出粉末（內(nèi)容物為顆粒狀的應(yīng)研細(xì)）裝片，或透化裝片。2)

片劑可取2~3片，水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等（有包衣者除去包衣）取數(shù)丸或1~2錠，置于乳缽中研細(xì)，取出適量粉末裝片，或透化裝片。

3)

蜜丸劑樣品可用兩種方法處理：(1)用解剖刀沿蜜丸正中切開，從切面由外至內(nèi)刮取少許樣品，置載玻片中央，滴加適宜的試液，用玻璃棒攪勻。按上述粉末制片法裝片，或透化裝片。(2)將樣品切碎放入容器，加水?dāng)嚢柘礈欤缓?/p>