流式細胞術的原理與應用課件

流式細胞術原理和應用王秀莉2011.9.30一

簡介二構造及工作原理三FCM的數(shù)據(jù)分析FCM的應用實例舉例：細胞周期分布檢測流路(液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉換統(tǒng)計（分析系統(tǒng)）計算機二構造及工作原理

流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)流動室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)激光光源：目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細胞快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，每個細胞所攜帶熒光物質被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關，因此細胞需要足夠的光照強度。

光學系統(tǒng)信號散射光信號

FS細胞大小

SS細胞顆粒性熒光信號

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光學系統(tǒng)散射光信號——細胞大小及顆粒性FSSS光學系統(tǒng)光路（濾片特性）光學系統(tǒng)流式細胞儀光路圖Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光學系統(tǒng)電路電壓調節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號放大方式檢測系統(tǒng)電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。細胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細胞膜表面抗原等的檢測時，細胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)光路補償

FITC/PE/ECD/PC5三FCM的數(shù)據(jù)分析單參數(shù)一維直方圖縱坐標表示細胞數(shù)，橫坐標表示相對熒光信號或散色光信號值，單位是道數(shù)。2.雙參數(shù)二維點圖顯示來自同一細胞的兩個參數(shù)與細胞數(shù)量間的關系。橫、縱坐標分別表示兩個參數(shù)的相對含量。通過分別計算兩坐標所表示參數(shù)的陽性率來得到實驗結果。3.等高線圖4.密度圖白血病免疫分型HLA-B27:強直性脊柱炎淋巴細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網(wǎng)織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗1流式細胞術的臨床應用四FCM的應用細胞大小細胞的顆粒度細胞表面分子：CD系列細胞漿內分子：胞內細胞因子細胞核內分子：P53細胞功能檢測：細胞周期、凋亡2流式細胞術的科研應用熒光信號的定量可以用平均熒光強度（mean值），熒光信號面積（Area，A）來表示。1）蛋白表達的檢測2）DNAAnalysisPIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主動進入細胞，需要固定打孔488nm激發(fā)為脂溶性，主動進入細胞UV激發(fā)常用的DNA染料02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisCount2N4NG2MG0G1s02004006008001000PIFluorescence2N4NDNAAnalysis3）Apoptosis檢測A）DNA片斷化檢測細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發(fā)生濃縮,染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成50~300kbp長的DNA大片段,或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段B）Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。C）AnnexinVAssay磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中,Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合AnnexinVAssay能夠區(qū)分死亡與凋亡D）TUNEL

細胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記