毛泡桐葉中烏索酸的提取分離及反相高效液相色譜分析

毛泡桐葉中烏索酸的提取分離及反相高效液相色譜分析【摘要】目的提取鑒定毛泡桐葉中的烏索酸，并建立其含量測(cè)定方法。方法采用“醇提凝析法”新工藝分離制備烏索酸，IR，MS，NMR鑒定其結(jié)構(gòu)。建立反相高效液相色譜測(cè)定其含量的方法，色譜柱為KromasilC18柱，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-磷酸，流速ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫25℃。結(jié)果烏索酸在～μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。樣品烏索酸含量為%，得率為%。結(jié)論“醇提凝析法”分離制備烏索酸工藝先進(jìn)，實(shí)用可行，為工業(yè)試驗(yàn)生產(chǎn)烏索酸提供了技術(shù)條件；RP-HPLC法測(cè)定烏索酸含量準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好、線性范圍寬，可作為控制烏索酸質(zhì)量的方法。

【關(guān)鍵詞】毛泡桐葉烏索酸結(jié)構(gòu)表征反相高效液相色譜

Abstract：Objective：ToextractandidentifyursolicacidfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesandtoestablishadeterminationmethodofursolicacid.Methods：UrsolicacidwasextractedfromPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesbyadoptinganewmethodofethanolextractionandagglutinationseparation,anditsstructurewasidentifiedbyIR,MSandNMR.AdeterminationmethodofursolicacidinPaulowniatomentosa(Thunb.)Steudleavesbyreversed-phasehighperformanceliquidchromtographwasestablished.Thechromatographiccolumn(KromasilC18,mm×250mm,5μm),acetonitrile-methanol-water-phosphoricacidmobilephase(168:682:150:,V/V)withml/minflowrate,thedetectedwavelength(210nm)andthecolumntemperature(25℃)wereadopted.Results：Ursolicacidshowedgoodlinearrelationshipintherangeof～μg(r=6).Theaveragerecoveryratewas%(RSDwas%).Thecontentwas%andthegainratewas‰.Conclusion：Themethodofethanolextractionandagglutinationseparationtoextractursolicacidisadvanced,rational,practicalandfeasible,anditprovidestechnologyconditionforindustrialproductionofursolicacid.RP-HPLCissimpleandaccurate,ithasgoodrepeatabilityandwiderlinearrange,anditcanbeusedtoevaluatethequalityofursolicacid.

Keywords：Paulowniatomentosa(Thunb.)Steudleaf;Ursolicacid;Structuralcharacteristics;RP-HPLC

毛泡桐葉為玄參科泡桐屬植物毛泡桐Paulowniatomentosa(Thunb.)Steud的葉子［1］。泡桐的藥用價(jià)值我國(guó)古代就有記載，《本草綱目》記有“桐葉主惡蝕瘡著陰皮主五痔、殺三蟲，花主傅豬瘡，消腫、生發(fā)?！迸萃┑幕?、葉、果、木、皮、根均可入藥［2］。泡桐葉含桃葉珊瑚苷、泡桐苷、毛蕊花苷、異毛蕊花苷、糖苷、多酚類［2］及熊果酸、乙酰熊果酸α,β［3］等，其中三萜酸類，特別是烏索酸和齊墩果酸，具有抗菌、抗肝炎、抗腫瘤、降血糖血脂、增強(qiáng)免疫功能等多種藥理作用，已引起人們廣泛的關(guān)注［5，6］。為此，我們以毛泡桐葉為原料，采用“醇提凝析法”提取分離烏索酸［5，6］，并建立RP-HPLC測(cè)定分析烏索酸含量的方法，為開發(fā)利用豐富的毛泡桐藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1器材與方法1材料

毛泡桐葉采自江西宜春市宜春學(xué)院北校區(qū)，經(jīng)江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為紫花毛泡桐(Thunb)Steud的葉子。95%乙醇；“YCXY-1號(hào)”除雜劑；復(fù)合酶制劑；活性炭；甲醇；水為超純水；烏索酸對(duì)照品。2儀器Waters系列高效液相色譜儀；Perkin-Elmer傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó))；Autospec-UltimaETOFEL型質(zhì)譜儀(美國(guó))；INOVA-600型、BruckerACF-400型核磁共振儀(美國(guó))；Boetius顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京)；WZZ-1S數(shù)字式自動(dòng)旋光儀(上海)；RO-MB-10D高純水機(jī)(杭州永潔達(dá)膜分離設(shè)備廠)，CP225D電子分析天平(德國(guó)Sartourius公司)，F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)，202-26A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。3烏索酸的提取分離工藝流程見圖1。操作步驟采用“醇提凝析法”提取分離。將干燥后的毛泡桐葉10kg粉碎成粗粉，用溫水濕潤(rùn)，加入原料干重1%的復(fù)合酶制劑，38℃酶解處理24h，濾干，加入8倍重量90%乙醇，85℃回流提取2次，1h/次，合并提取液，過濾，減壓回收乙醇得浸膏，以純水沉降洗滌后加“YCXY-1號(hào)”除雜劑除雜處理2次，過濾，用95%乙醇溶解，調(diào)pH值堿化，加活性炭脫色，過濾除雜，再用95%乙醇溶解，調(diào)pH值酸化，凝析分離、純化精制，80℃干燥24h，得無色針狀結(jié)晶，得率為‰。

2結(jié)果

樣品結(jié)構(gòu)鑒定樣品IRKBrmaxυcm-1：3434(-OH)、2968、2927、2871、1694、1456、1384、1031；EI-MS(m/z)：456(M+)、441、438、423、411、410；D、E環(huán)離子a：248(a-100)、203(a-COOH)、189(a-CH2-COOH)、133；A、B環(huán)離子b：208(b)、207(b-H)、190(b-H2O)和189；1H-NMR(DMSO-d6)示5個(gè)季碳甲基：；2個(gè)叔碳甲基(δ，J=;，J=，各3H，d)；C18(δ，J=，d)；C3α-H(δ，J=，，，1H，td，)；C12-H(δ，J=，1H，t)；C15-H(δ，J=，1H，brd)；C16-H(δ，J=，，1H，td)；C29-H(δ，J=，3H，d)；C30-H(δ，J=6Hz，3H，d)；13C-NMR(DMSO-d6)示7個(gè)伯碳：δ(C23)、(C24)、(C25)、(C26)、(C27)、(C29)、(C30)；9個(gè)仲碳：δ(C1)、(C2)、(C6)、(C7)、(C11)、(C15)、(C16)、(C21)、(C22)；7個(gè)叔碳：δ(C3)、(C5)、(C9)、(C12)、(C18)、(C19)、(C20)；6個(gè)季碳：δ(C4)、(C8)、(C10)、(C13)、(C14)、(C17)；1個(gè)羧基碳：(C28)。

以上光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致［7，8］，根據(jù)光譜數(shù)據(jù)確證樣品為烏索酸。

烏索酸樣品含量測(cè)定

對(duì)照品溶液配制精密稱定烏索酸對(duì)照品mg，置于10ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品溶液。

樣品溶液配制精密稱定烏索酸樣品mg，置于10ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液。

檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取烏索酸對(duì)照品和樣品溶液進(jìn)樣，在190～500nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光譜掃描，烏索酸在流動(dòng)相中的最大紫外吸收波長(zhǎng)均為nm(見圖2)，但由于流動(dòng)相在短波長(zhǎng)處有末端吸收，為了消除背景，提高信噪比，提取不同波長(zhǎng)的色譜圖進(jìn)行比較，選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)信噪比高，峰形好，干擾小，最大限度地保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確。

色譜條件色譜柱為KromasilC18柱；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-磷酸；流速ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫為25℃。以烏索酸計(jì)，理論塔板數(shù)分別為16675，分離度為，對(duì)稱因子分別為，外標(biāo)法定量分析。

線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)用微量注射器精密吸取烏索酸對(duì)照品溶液1，2，6，10，14，18μl進(jìn)樣分析，平行3次，按色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得烏索酸回歸方程為：Y=×105X+×104。表明當(dāng)烏索酸進(jìn)樣量在～μg之間時(shí)，線性關(guān)系良好。

精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取烏索酸對(duì)照品溶液10μl進(jìn)樣，重復(fù)5次，測(cè)得烏索酸峰面積RSD為%(n=5)，本方法精密度良好。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批烏索酸樣品5份，配制樣品溶液，吸取10μl進(jìn)樣分析，測(cè)得烏索酸峰面積RSD為%(n=5)，本方法重復(fù)性好。

烏索酸含量測(cè)定吸取樣品溶液10μl進(jìn)樣分析，重復(fù)進(jìn)樣5次，樣品中烏索酸的含量為%。

3討論

泡桐是玄參科落葉喬木，原產(chǎn)于我國(guó)，現(xiàn)有9個(gè)種，4個(gè)變種［1］，國(guó)內(nèi)分布廣泛，資源豐富。毛泡桐葉中不僅烏索酸含量較高，而且其同分異構(gòu)體齊墩果酸含量極低，經(jīng)研究測(cè)定其葉中烏索酸含量高達(dá)‰［9，10］，為烏索酸的開發(fā)開辟了新的原料路線。

采用“醇提凝析法”新工藝，從毛泡桐中提取分離烏索酸，僅以乙醇為溶劑，未加其它有機(jī)溶劑，采用自制的“YCXY-1號(hào)”除雜劑，有效去除脂類、類脂類、酚類及葉綠素等雜質(zhì)，不僅提高了產(chǎn)品的安全性，而且簡(jiǎn)化了工藝流程，降低了生產(chǎn)成本，有利于烏索酸的富集和純化，其含量達(dá)%，得率達(dá)%，具有制備量大，質(zhì)量穩(wěn)定，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。

本研究選用乙腈-甲醇-水體系為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相洗脫速度達(dá)ml·min-1時(shí)，烏索酸與其同分異構(gòu)體齊墩果酸達(dá)到了基線分離，但峰形拖尾，這是由于結(jié)構(gòu)中的羧基存在解離現(xiàn)象，加入適量磷酸能有效抑制其解離，使拖尾現(xiàn)象得以改善，峰形尖銳對(duì)稱。經(jīng)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)選定流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水-磷酸，流速為ml·min-1。

烏索酸在流動(dòng)相中的紫外吸收光譜顯示其最大吸收波

長(zhǎng)為nm，但溶劑甲醇在短波長(zhǎng)處亦有吸收，為減少干擾，且不至于降低檢測(cè)的靈敏度，故確定210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

采用該實(shí)驗(yàn)建立的RP-HPLC法測(cè)定毛泡桐中烏索酸的含量，樣品處理簡(jiǎn)單，無其它雜質(zhì)的干擾，方法簡(jiǎn)便、快速，分離效果好，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，為相關(guān)植物中烏索酸含量的測(cè)定提供了科學(xué)的分析手段。

致謝：烏索酸的質(zhì)譜、核磁共振譜由中國(guó)海洋大學(xué)藥物研究所李英霞教授代測(cè)。

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