1105-哺乳動物組織基因組DNA提取課件

2023/10/61GenomicDNAExtractionfromMammalTissue哺乳動物組織基因組DNA提取2023/10/62一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?ExperimentalPurpose)Aftertheexperimentdone,studentsshouldbeabletoknowhowtoextractgenomicDNAfrommammaltissue.掌握動物基因組DNA提取的操作方法。2023/10/63細(xì)菌-原核細(xì)胞(prokaryote)無真正的細(xì)胞核真核細(xì)胞(eukaryote)有真正的細(xì)胞核，還有很復(fù)雜的細(xì)胞器2023/10/64動物細(xì)胞特有中心體，高等植物細(xì)胞特有細(xì)胞壁，葉綠體和液泡動物細(xì)胞(animalcell)

植物細(xì)胞(plantcell)2023/10/65二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciple)Intheproceduredescribedhere,theSDS(sodiumdodecylsulfate)areaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis.ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins.

本實(shí)驗(yàn)利用去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉)是為了使蛋白變性并溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而細(xì)胞裂解物又常用蛋白酶K和RNA酶進(jìn)行水解處理。2023/10/66真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)2023/10/67Thisisgenerallyfollowedbyphenolofphenol:chloroformextractiontoremovetheremainingproteins,whichwilleitherentertheorganicphaseor,ifdenatured,appearattheinterphase.Chloroformtreatmentisusedtoremovethephenol,andalcoholprecipitationconcentratestheDNAwhileremovingimpurity.

隨后用酚︰氯仿進(jìn)行抽提，以去除殘留的蛋白質(zhì)，這時蛋白質(zhì)將進(jìn)入有機(jī)相，或者假如己變性的話將呈現(xiàn)在有機(jī)相與水相之間。氯仿處理是為了去除苯酚，而乙醇沉淀處理則可以濃縮DNA，同時去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。2023/10/68Asafurtherprecaution,ethylenediaminetetraace-ticacid(EDTA)isinclude-edinthebufferstochelateMg2+.Thiswillreducedeoxyribonuclease(DNase)activitybecauseoftheMg2+requirementoftheseenzymes.

為了進(jìn)一步保護(hù)DNA樣品的完整性，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，這樣將會減少脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因?yàn)樵撁副仨氃谟蠱g2+存在時才會起作用。2023/10/69ThemethoddescribedhereresultinDNAthatiseasilycutwithrestrictionenzymesand,therefore,isusefulforSouthernHybridizationstudies.IftheDNAistobeusedtoconstructaclonebank,highermolecularweightDNAisdesirable,sothevortexstepshouldbeeliminated.

本實(shí)驗(yàn)方法分離得到的染色體DNA樣品易被限制酶切割，因此，較適用于Southern雜交的研究。如果所制備的基因組DNA是用于構(gòu)建克隆文庫，要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟。2023/10/610核酸的分離純化、測定及研究方法一、

分離核酸的一般原則

因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級結(jié)構(gòu)中，故完整的一級結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。2023/10/611（一）核酸的分離和純化時應(yīng)遵循兩個原則

①保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；

②排除其它分子的污染。

（二）核酸的純度要求

①

核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA，反之亦然。2023/10/612（三）核酸分離純化的注意事項(xiàng)為保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；④減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。

2023/10/613高溫：如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對核酸的生物降解。

機(jī)械剪切力：包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。

2023/10/614二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解。核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點(diǎn)而定。對于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。2023/10/615三、試劑與器材（Reagentsandapparatus）

Ⅰ.Instruments

Highspeedrefrigeratedcentrifuge（高速冷凍離心機(jī)）、Glasshomogenizer（玻璃勻漿器）

、ElectrophoresisSystem（電泳系統(tǒng)）

、Ultraviolettransilluminator（紫外透射儀）

、Ultracoldstoragefreezer（超低溫冰箱）

、Autoclave（高壓滅菌鍋）

、Pipettes（微量加樣器）

、Electronicbalance（電子天平）

、

Acidometer（酸度計）2023/10/616Ⅱ.Materials

Liverofmice2023/10/617Ⅲ.ReagentsTris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane

（三羥甲基氨基甲烷）、SDSsodiumdodecylsulfate,sodiumsalt(十二烷基硫酸鈉)、EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid(乙二胺四乙酸)、HClhydrochloricacid（鹽酸）、NaOHSodiumhydroxide（氫氧化鈉）、Sodiumacetate(醋酸鈉)、

Aceticacid（冰乙酸）、Phenol（平衡酚）、Chloroform（氯仿）、Isoamylol（異戊醇）、Ethanol（乙醇）、TEbufferProteaseK（蛋白酶K）、RNaseA（RNA酶）、Agarose（瓊脂糖）、DNAmolecularweightmarkers（DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物[MarkDNA]）、Boricacid硼酸、Sugar蔗糖、Bromophenolblue溴酚藍(lán)、Fluorescentdye(熒光染料)[Gelview]2023/10/618溶液的配制摩爾質(zhì)量的計算:質(zhì)量(g)分子量例：5mol/LNaCl分子量58.4450ml

x58.44密度的計算：÷0.05(L)

＝5（mol/L）x＝14.61（g）÷體積(L)＝摩爾體積（mol/L）質(zhì)量(g)體積（V）＝密度（g/ml）2023/10/619(1)5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解292g氯化鈉于足量的水中，定容至1000ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:

配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽?；蚍Q取186.2g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，pH調(diào)至8.0，并溶于約900ml水中，定容至1000ml。（3)3mol/L乙酸鈉（NaAc）：溶解204g的三水乙酸鈉于約450ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到500ml。2023/10/620(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含90ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解定容至100ml。(5)5mol/L氫氧化鈉（NaOH）：溶解20g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。2023/10/621(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份(1ml)貯存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（無DNase）（DNase-freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris-HCl調(diào)pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）2023/10/622(9)

1mol／L

Tris緩沖液（Tris·HClbuffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。濃鹽酸的體積（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.22023/10/623四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器

冰冷的生理鹽水清洗配制工作液處死小鼠取出肝臟

組織勻漿液

酶解液2ml勻漿液

組織細(xì)胞液

玻璃勻漿器勻漿移至1.5ml離心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul

離心無菌水酶解液水浴處理（55℃、12—18h）

2023/10/624工作液配置：貯備液摩爾濃度×貯備液（體積）＝工作液摩爾濃度×工作液（體積）例：組織勻漿液（10ml）貯備液摩爾濃度：5mol／LNaCl

工作液摩爾濃度：100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10mlx＝0.2ml2023/10/625組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmol/LNaCl：

0.2ml（5mol/LNaCl）25mmol/LEDTA：

0.5ml（0.5mol/LEDTApH8.0)10mmol/LTris·HCl：

0.1ml（1mol/LTris·HClpH8.0)加三蒸水:9.2ml2023/10/626酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol/LNaCl：

0.04ml

（5mol/LNaCl）50mmol/LEDTA：

0.1ml

（0.5mol/LEDTApH8．0)20mmol/LTris·HCl：

0.02ml（1mol/LTris·HClpH8．0)1%SDS：

0.5ml

（2%SDS）200μg/mL蛋白酶K：

0.02ml

（10mg/ml）

加三蒸水:0.32ml2023/10/627無DNA酶的RNA酶（-20℃保存）

10mmol/LTris·HCl將胰RNA酶溶于濃度10mg／mL

15mmol/LNaCl

于100℃水浴處理15min以降解DNA酶緩慢冷卻到室溫。2023/10/628四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內(nèi)加入20ul的RNase加入等體積①提取液

4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制

TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc

無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

2023/10/629平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：24：1

(體積比)即配即用

每管加500ul

平衡酚(pH8.0)：250ul

氯仿：240ul

異戊醇：10ul2023/10/630氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用

每支試管加500μl

氯仿：480μl

異戊醇：20μl2023/10/631TE緩沖液1ml10mmol/LTris·HCl：

10μl（1mol/LTris·HClpH8.0)1mmol/LEDTA：

2μl（0.5mol/LEDTApH8.0)加三蒸水0.988ml至1ml2023/10/632核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質(zhì)變性劑，更有效去除蛋白質(zhì)。氯仿還可加速有機(jī)相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標(biāo)準(zhǔn)程序：酚——酚-氯仿——氯仿。2023/10/633酚抽提除去蛋白質(zhì)的示意圖2023/10/634四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內(nèi)加入20ul的RNase加入等體積①提取液

4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制

TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc

無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

2023/10/635核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶，也不會變性。醋酸鈉為沉淀DNA、RNA的最常用鹽類。有機(jī)溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇。溫度：冰水2023/10/636四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內(nèi)加入20ul的RNase加入等體積①提取液

4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制

TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc

無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

2023/10/637四、實(shí)驗(yàn)步驟(ExperimentalProcedures)AgaroseGelElectrophoresis：

Preparationofthegel

制備0.3％瓊脂糖凝膠

LoadingDNAsamples

DNAsamples16μl+Loadingbuffer4μl

Gel

電壓120VGelphotography2023/10/6381.制備0.3％瓊脂糖凝膠。稱取