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全內(nèi)反射熒光顯微成像技術(shù)
長壽的發(fā)展要求研究人員從單分子層面觀察細(xì)胞生命活動的細(xì)節(jié),進(jìn)一步揭示生命活動的過程。目前,國際上公認(rèn)最具前途的單分子光學(xué)成像技術(shù)有全場相襯顯微術(shù)、激光共聚焦顯微術(shù)、近場光學(xué)掃描顯微術(shù)和全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)(TotalInternalReflectionFluorescence,TIRF)是近些年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù),該技術(shù)利用全內(nèi)反射時產(chǎn)生的隱失波照明樣本,使照明區(qū)域限定在樣品表面薄層范圍內(nèi),有效控制了激發(fā)體積,因此具有其它光學(xué)成像技術(shù)無法比擬的高信噪比和對比度。21世紀(jì)80年代,Axelrod等生物物理學(xué)家對全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)進(jìn)行了描述并探索了其生物學(xué)應(yīng)用。20世紀(jì)90年代,隨著新型的物鏡透鏡和超靈敏探測器的出現(xiàn),該技術(shù)得到了充分的發(fā)展。目前,該技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及其它研究領(lǐng)域。一、原理1.sell定律當(dāng)一束光線經(jīng)過兩個不同折射率的介質(zhì)時,部分光線會于介質(zhì)的界面被折射,其余的則被反射。入射角和折射角的關(guān)系滿足Snell定律:當(dāng)光線由光密介質(zhì)(如玻璃,n1=1.5~1.7)進(jìn)入到光疏介質(zhì)(如水,n2=1.33)時,當(dāng)入射角θ1逐漸增大至某一程度時,折射角θ2恰好為90°,該入射角稱作臨界角θc,依據(jù)Snell定律得出:當(dāng)入射角θ1大于臨界角θc時,光線則不再透射入光疏介質(zhì),而是在臨界面被全部反射,即發(fā)生了全內(nèi)反射(如圖1所示)。2.隱失波照明的成像原理當(dāng)一束光線穿過兩種不同折射率的介質(zhì)(以玻璃與水為例),并且發(fā)生全內(nèi)反射現(xiàn)象時,從幾何光學(xué)的角度來看,光線會在玻璃與水的臨界面上發(fā)生完全反射而不進(jìn)入水溶液中。但實(shí)際上,由于波動效應(yīng),有一部分光的能量會透過臨界面滲透到水溶液中,平行于界面向水溶液中的傳播,這一部分透過的能量場則稱之為“隱失波”(或“隱失場”)。隱失波的頻率與入射光線的頻率相同,其強(qiáng)度隨臨界面的垂直距離呈指數(shù)衰減:其中:I(z)表示距離界面Z處的強(qiáng)度;I(0)表示臨界面處的強(qiáng)度。隱失波穿透樣品的深度d,則與入射光線的波長和角度有關(guān)(如圖2所示):其中:d表示隱失波穿透深度;λ0表示入射光線波長;θi表示入射角度。由于隱失波僅沿著臨界面極薄的一層范圍內(nèi)傳播,所以利用隱失波照明樣本,可以僅激發(fā)緊貼近蓋玻片的一薄層范圍內(nèi)(大約100nm~300nm)的熒光基團(tuán),而更深層溶液中的熒光基團(tuán)不被激發(fā),因此極大地提高顯微成像的信噪比和對比度。使得所呈圖像的Z軸方向的分辨率得到了顯著改善。二、物鏡的配置應(yīng)用到目前為止,科學(xué)家們已經(jīng)研制出了多種全內(nèi)反射熒光顯微成像系統(tǒng),其中最為常用的是兩種類型:棱鏡型和物鏡型(如圖3所示)。在棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)中,入射光通過棱鏡進(jìn)入玻璃/水溶液界面,在另一側(cè)的顯微鏡物鏡收集熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光。棱鏡型系統(tǒng)只需要有激光光源、棱鏡和顯微鏡,即可根據(jù)使用者的需求來配置顯微鏡。其優(yōu)勢在于,從實(shí)現(xiàn)的角度來看相對簡單、成本較低,從探測角度來看,不易受入射光源信號的影響,所以其成像的信噪比較高。但是由于放置樣品的空間受到棱鏡的限制,所以不利于進(jìn)行活細(xì)胞或組織的研究。在物鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡系統(tǒng)中,物鏡既作為發(fā)生全內(nèi)反射的光學(xué)器件,同時又作為收集樣品熒光信號的接收器。由于細(xì)胞的典型折射率為1.33~1.38,因此要實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射,則要求使用數(shù)值孔徑(N.A.)較高的物鏡,即:其中:n、θ分別為物鏡的折射率(浸沒油)和孔徑角,θc為發(fā)生全內(nèi)反射時的臨界角。所用物鏡的數(shù)值孔徑越高,則有更多的孔徑范圍可被利用,且更易于校準(zhǔn)光束,而這對制造工藝的要求也就越高。在物鏡型系統(tǒng)中,解決了棱鏡型系統(tǒng)中樣品空間限制的問題,不僅更適用于活細(xì)胞的觀察,也有利于與其它技術(shù)相結(jié)合,所以具有更廣闊的生物學(xué)應(yīng)用前景。三、z軸上的熒光切片成像技術(shù)細(xì)胞內(nèi)很多至關(guān)重要的生命活動過程都是在細(xì)胞膜表面完成的,例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、病原體侵入等。所以直接觀察細(xì)胞膜表面的生命活動過程,對于生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究來說具有極其重要的意義。利用全內(nèi)反射熒光顯微術(shù),可以僅激發(fā)深度在100nm~300nm薄層范圍內(nèi)的熒光基團(tuán),而不受其它層面的熒光信號的干擾,與其它光學(xué)切片成像技術(shù)相比其在Z軸上的分辨率獨(dú)具優(yōu)勢,因此該技術(shù)現(xiàn)已成為用于研究細(xì)胞表面科學(xué)如生物化學(xué)動力學(xué)、單分子動力學(xué)的最有前途的光學(xué)成像技術(shù)之一。全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)在生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個方面:選擇性觀察細(xì)胞與基底面接觸區(qū)域;對貼近支持物表面的單分子熒光的觀察和光譜分析;觀察活細(xì)胞分泌過程中分泌顆粒的運(yùn)動軌跡;胞外或胞內(nèi)蛋白與細(xì)胞表面受體或人工合成膜結(jié)合的動態(tài)觀察;對活細(xì)胞的微形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和動力學(xué)分析;對培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育過程進(jìn)行長時間熒光觀察等。鑒于全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)的特點(diǎn),該技術(shù)在單分子研究方面的貢獻(xiàn)尤為突出。在過去十幾年內(nèi),該技術(shù)已被科學(xué)家們廣泛地應(yīng)用于分子馬達(dá)的運(yùn)動、活細(xì)胞中單分子成像、生物大分子的相互作用、生物大分子的構(gòu)象變化、ATP酶反應(yīng)、單分子的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)等研究領(lǐng)域。四、發(fā)展活細(xì)胞觀察生命科學(xué)的發(fā)展離不開技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展,全內(nèi)反射熒光顯微術(shù)經(jīng)過十幾年的迅速發(fā)展,現(xiàn)已成為生物單分子研究的必備工具之一。在未來一段時間內(nèi),隨著高靈敏度、高采集效率熒光探測器的不斷發(fā)展,必將使該技術(shù)在活細(xì)胞觀察方面的優(yōu)勢得到更充分的發(fā)揮。近些年來,人們也逐漸開始關(guān)注雙色或多色全內(nèi)反射熒
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