海帶多糖的含量測(cè)定方法正確性研究

海帶多糖的含量測(cè)定方法正確性研究【摘要】目的探索正確測(cè)定海帶多糖含量的方法。方法采用苯酚-硫酸法，按照不同糖溶液配制標(biāo)準(zhǔn)液在485nm處測(cè)定多糖含量。結(jié)果按照多糖中褐藻糖與半乳糖比例為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得多糖含量為%，介于兩種組成單糖測(cè)定結(jié)果之間。結(jié)論按照多糖中單糖組成比例為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定多糖含量具有可比性，可用于海帶多糖含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】海帶多糖苯酚硫酸法

Abstract：ObjectiveTodeterminethecontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica.MethodsWeusedthemethodofvitriliccolorimetry,anddetectionwavelengthwas485contentofpolysaccharideswiththemethodwhichwasaccordingtothecomposingsugarswas%.ConclusionThismethodcanbeusedtodeterminethecontentofpolysaccharidesinLaminariajaponica.

Keywords：Laminariajaponica;Polysaccharides;Phenol-vitrioliccolorimetry

海帶Laminariajaponica，又名綸布、昆布、江白菜，是多年生大型食用藻類。藻體為長(zhǎng)條扁平葉狀體，褐綠色，有兩條縱溝貫穿于葉片中部，形成中部帶，一般長(zhǎng)～3m，寬15～25cm，最長(zhǎng)者可達(dá)6m，寬可達(dá)50cm。海帶生于海邊低潮線下2m深度的巖石上，人工養(yǎng)殖生長(zhǎng)在繩索或竹材上，是我國(guó)、日本、朝鮮等東方人喜歡食用的經(jīng)濟(jì)藻類。我國(guó)海帶養(yǎng)殖已發(fā)展成大規(guī)模產(chǎn)業(yè)，從遼寧一直到廣東沿海，產(chǎn)量約占世界海藻的50％，居世界第1位。海帶成本低廉，功能眾多，在有益物質(zhì)提取和食品加工中作用明顯，市場(chǎng)潛力很大［1］。

海帶富含多種功能性成分，如碘、甘露醇、維生素A、維生素B、維生素C、?；撬?、海帶多糖等，其食用和藥用價(jià)值很早即為世人所關(guān)注［2］。研究表明，海帶對(duì)外界惡劣環(huán)境所表現(xiàn)出來(lái)的抗逆耐受能力與它們所含的海帶多糖有直接關(guān)系，海帶多糖還具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的功能。海帶多糖在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景［3］。我國(guó)在對(duì)海帶多糖的研究中所用的實(shí)驗(yàn)材料多是粗制品，缺乏純化和組成鑒定過(guò)程，對(duì)海帶的利用也局限于提取褐藻酸、甘露醇等。許多文獻(xiàn)中，測(cè)定海帶多糖時(shí)用葡萄糖或其組成的主要單褐藻糖作標(biāo)準(zhǔn)溶液，造成結(jié)果與真實(shí)值相差太大。本文采用水提醇沉的方法對(duì)海帶多糖的進(jìn)行提取、純化，并采用按照組成樣品的單糖比例配制標(biāo)準(zhǔn)液的測(cè)定方法對(duì)其多糖含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)幾種測(cè)定方法進(jìn)行比較和準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。

1材料與儀器

海帶采自青島沙子口，經(jīng)鑒定為L(zhǎng)aminariajaponica；95％乙醇、濃硫酸、六水合氯化鎂、氫氧化鈉、三氟乙酸、鹽酸羥胺等均為國(guó)產(chǎn)分析純；5%苯酚；L－褐藻糖；D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖等均購(gòu)自于上海試劑二廠；肌醇。高壓鍋；FA1004電子天平；722型分光光度計(jì)；瑞士BüCHIR－114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；東京理化EYELAFD－5N型真空冷凍干燥機(jī)；電熱恒溫水浴鍋；TDL－40B離心機(jī)；HP5890Ⅱ氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器。

2方法與結(jié)果

海帶多糖樣品的制備

采用水提醇沉法提取純化海帶多糖樣品。

樣品組成單糖的確定

氣相色譜條件

SGEAC225mm×30m彈性石英毛細(xì)管柱；柱溫215℃；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度250℃；分流比100∶1；高純氮?dú)鉃檩d氣，流速1ml/min。

標(biāo)準(zhǔn)糖樣衍生物的制備

分別稱取4～6mg的L-褐藻糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、葡萄糖、L-鼠李糖以及1mg的肌醇置1ml的離心管中，加入10mg鹽酸羥胺和ml的吡啶，在90℃水浴中加熱反應(yīng)30min，并不時(shí)振蕩。取出后冷卻至室溫，加入ml的乙酸酐，于90℃水浴中繼續(xù)進(jìn)行乙酰化反應(yīng)30min，并不時(shí)振蕩，冷卻后即得適于氣相色譜分析的標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物［4］。

樣品水解

稱取多糖樣品各1份，分別置于10ml水解管中，加10ml2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液溶解，封管，100℃水浴中水解4h,減壓濃縮至干。

組成樣品單糖的確定

根據(jù)色譜圖，確定組成樣品的單糖為:鼠李糖、褐藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖，但褐藻糖和半乳糖含量遠(yuǎn)多于其它幾種單糖，兩者含量比例為∶1。結(jié)果見圖1～2。

多糖含量測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取葡萄糖、L-褐藻糖和D-半乳糖各50mg，分別溶于容量瓶中配成100ml溶液。按褐藻糖與半乳糖比例:1，從兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各取ml和ml形成混合溶液為標(biāo)準(zhǔn)液。

分別精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、褐藻糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，，，，，，ml置于具塞試管中，加水使每管總體積為ml，然后分別加入5％苯酚液ml，混合均勻后快速加入95％濃硫酸5ml,室溫放置30min，在485nm下測(cè)定吸光度。以蒸餾水試管為空白對(duì)照，繪制吸光度與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

樣品含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的樣品100mg，置于100ml容量瓶中，加水至刻度。吸取樣品溶液ml置于具塞試管中，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的步驟，測(cè)得樣品吸光度，根據(jù)上述4種標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖含量。經(jīng)計(jì)算，樣品含量分別為％，％，％，％。

方法正確性驗(yàn)證

已知蔗糖組成的單糖比例為葡萄糖:果糖＝1∶1,從已經(jīng)配好的葡萄糖和果糖兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液中各取相同適量配成混合標(biāo)準(zhǔn)液。按照上述比色條件分別以葡萄糖、果糖和混合標(biāo)準(zhǔn)液做標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定多糖含量，得到其含量分別為％，％和％。由此證明按照組成多糖的單糖比例作標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定含量具有一定的準(zhǔn)確性。

3討論

由圖3可知，同一樣品用不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線是不重合的，由此測(cè)得含量值是不同的。從圖中標(biāo)準(zhǔn)曲線看出，混合液的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率位于組成兩種單糖的斜率之間。對(duì)雜多糖而言，測(cè)定值總是與真實(shí)值有差別，但對(duì)于未知確切組成比例的樣品，可用主要組成單糖為標(biāo)準(zhǔn)；若知道其確切比例，就可以用混合液作標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)際測(cè)定時(shí)，根據(jù)所選取的標(biāo)準(zhǔn)溶液做的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率偏差，選取適當(dāng)?shù)姆椒ㄗ鳛闇y(cè)定方法可得到近似結(jié)果。

海帶多糖為雜多糖，由7種以上的單糖組成，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。本文通過(guò)采用氣相色譜測(cè)定其組成單糖的確切比例。按照其主要單糖的比例作標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定其多糖含量，可得到較準(zhǔn)確的結(jié)果。

海帶多糖初步藥理研究表明，其具有免疫調(diào)節(jié)、降血脂、抗凝血等活性。樣品中的多糖含量較高，可能是此活性較優(yōu)的原因之一。海帶多糖的結(jié)構(gòu)組成和生理活性的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

［1］劉樹立，王春艷.我國(guó)海帶的加工利用和開發(fā)［J］.食品與藥品，2007，9