Chapter 04 基因組序列的功能解析

第四章

基因組序列的功能解析第一節(jié)在基因組中識(shí)別基因一、識(shí)別候選基因1.生物信息分析基因的序列特征雙鏈DNA有6個(gè)ORFs閱讀方式（1）開放閱讀框架

(ORF，openreadingframe)從起始密碼至終止密碼（2）ORF的平均長(zhǎng)度大腸桿菌：317個(gè)密碼,酵母菌：483個(gè)密碼,人：約450個(gè)密碼.在原核生物中直接尋找ORF有效。在真核生物中不能直接尋找ORF。在真核生物中不能直接尋找ORF的原因：●62%的人類基因被間隔開●有內(nèi)含子，斷裂基因●許多外顯子短于100個(gè)密碼，甚至有些少于50個(gè)密碼（3）對(duì)ORF掃描軟件的修正1）密碼偏愛在某種生物中并不是所有密碼都被均等使用。2）外顯子-內(nèi)含子邊界3）上游調(diào)控序列:CpG島:40–50%的人類基因和脊椎動(dòng)物基因中，5’上游的GC含量高4）尋找同源序列到其他模式生物中尋找同源序列。如果模式生物的同源序列已經(jīng)被鑒定為某個(gè)功能基因的話…..主要用途是對(duì)新序列進(jìn)行功能分析.2.通過實(shí)驗(yàn)技術(shù)識(shí)別基因

檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄RNA分子.起始密碼上游的數(shù)10個(gè)堿基，終止密碼下游的上百個(gè)堿基.包括：（1）核酸雜交實(shí)驗(yàn)1）Northernblotting選擇性剪接或者多基因家族都能產(chǎn)生多個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄物mRNA一般都是從一個(gè)組織或器官中得到的2）zoo-blot(gardenblot）用Southernblot把一個(gè)物種的DNA片斷與相關(guān)的其他物種的編碼基因DNA雜交Probesample（2）cDNA測(cè)序（3）PCR技術(shù)從cDNA文庫（cDNAlibrary）中篩選。1）RT-PCR(reversetranscriptasePCR)2）RACE(rapidamplificationofcDNAends)RACE（3）尋找外顯子-內(nèi)含子邊界.1）mRNA-DNA雜交2）外顯子捕獲需要特殊的載體二、確定某個(gè)基因的功能1.生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)基因功能通過生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)研究

.同源性查詢:原理：功能相似的基因具有相似的序列（1）序列同源性反映了共同祖先的進(jìn)化關(guān)系直系同源體（Orthologous）:來自不同的物種的同源基因旁系同源體（Paraloguos）:來自同一個(gè)生物的同源基因（2）同源性分析揭示基因或片斷的功能可以分析DNA序列，但一般需要把DNA轉(zhuǎn)化成氨基酸序列進(jìn)行分析。核酸序列76%相同(偶然事件)氨基酸序列只有28%相同！1）完整序列比對(duì)2）部分序列分析尋找共同擁有的結(jié)構(gòu)域（domain）.如tudordomain

結(jié)構(gòu)域是序列功能的核心。（3）同源性分析在酵母基因組計(jì)劃中的應(yīng)用30%

是通過同源性分析預(yù)測(cè)的

酵母基因組含有約6000個(gè)基因,其中30%

是通過常規(guī)的遺傳實(shí)驗(yàn)確定的.2.用實(shí)驗(yàn)確定基因功能（1）通過基因失活分析基因功能將基因突變，觀察由此引起的表型變化。1）同源重組失活“Lossoffunction”酵母的刪除盒用抗生素抗性基因替換酵母的某一處基因組序列基因敲除（knockout）小鼠胚胎干細(xì)胞（EScells）注射到小鼠胚胎嵌合體互相交配純合體敲除小鼠有些基因是至死基因，只能得到雜合體2）非同源重組的基因失活1）轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽：把轉(zhuǎn)座序列插入到基因中，使基因失活。讓轉(zhuǎn)座子帶上應(yīng)答元件，在外界的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)座。缺點(diǎn)：不能準(zhǔn)確失活一個(gè)基因，因?yàn)檗D(zhuǎn)座是個(gè)隨機(jī)事件。人工誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座：給Ty1

的上游加上半乳糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子2）RNA干涉（RNAinterference）與目標(biāo)基因序列互補(bǔ)的短雙鏈RNA能降解目標(biāo)基因的mRNA.在線蟲1號(hào)染色體上，2769個(gè)預(yù)測(cè)的基因中的2500分別被進(jìn)行了RNA干涉缺點(diǎn)：在哺乳動(dòng)物中只能對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行處理，因?yàn)镽NA在體內(nèi)的存在時(shí)間有限。（2）通過基因超表達(dá)分析基因功能“Gainoffunction”3.未知基因編碼的蛋白質(zhì)功能的精細(xì)研究（1）定向突變刪除或改變基因序列中的一部分Site-directedmutagenesis(體外定點(diǎn)突變):刪除一段插入一段突變個(gè)別堿基

1）寡核苷酸定點(diǎn)突變2）同源重組導(dǎo)入突變基因

兩步取代：第一步:用標(biāo)記基因取代原基因第二步:用突變基因取代標(biāo)記基因

失去標(biāo)記獲得標(biāo)記（2）報(bào)告基因（Reportergenes）和免疫組織化學(xué)reportergenes舉例確定基因表達(dá)的部位和時(shí)空特征.基因基因產(chǎn)物方法lacZ

β-半乳糖苷酶組織化學(xué)testuidA

β-葡糖苷酸酶組織化學(xué)testlux

熒光素酶生物發(fā)光GFP綠色熒光蛋白熒光1）報(bào)告基因2）免疫組織化學(xué)測(cè)定待測(cè)基因的啟動(dòng)子確定基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的位置研究不同組織的不同發(fā)育階段、不同疾病的轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物三、研究基因組的整體活性1.研究轉(zhuǎn)錄物組（1）基因表達(dá)系列分析（SAGE）鑒定細(xì)胞中的全部mRNA的相對(duì)豐度。③

把cDNA序列與基因組序列比較①把mRNA轉(zhuǎn)為cDNA②

把cDNA文庫中的每個(gè)克隆都測(cè)序轉(zhuǎn)錄物組學(xué)(transcriptomics)：是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科.基因表達(dá)系列分析(SAGE)12-bp短序列足夠特異412=16777216bpBsmFI切割10–14bp的下游.5′-AGCT-3