實(shí)驗(yàn)六-POD同工酶的提取分離活性測定定稿

Pleasebequiet,上課了??！小麥幼苗過氧化物酶同工酶的提取、分離實(shí)驗(yàn)七學(xué)時(shí)：9馮麗、石峰1、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和方法；2、掌握同工酶的概念；3、掌握實(shí)驗(yàn)試劑的配制。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、同工酶和電泳概念：2、影響電泳的主要因素：3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：5、凝膠的質(zhì)量決定因素：6、不連續(xù)PAGE的原理：（1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：(2)不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：

（3）

濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：

★

二、實(shí)驗(yàn)原理:

1、同工酶和電泳概念：（1）同工酶指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。同工酶與生物的遺傳，生長發(fā)育，代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定的關(guān)系，如過氧化物酶在細(xì)胞代謝過程中與呼吸作用，光合作用，及生長素的氧化等都有關(guān)系，測定POD活性或其同工酶，可以反映某一時(shí)期植物體內(nèi)代謝變化。（2）電泳是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。二、實(shí)驗(yàn)原理:

由有效遷移率μ＝mα＝qα/6πrη，則可推出：（1）帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；（2）顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；（3）溶液的粘度：

粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快；

2、影響電泳的主要因素：

（5）電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度越小，電泳速度越慢，反之越快；（6）離子強(qiáng)度：

離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；（7）電滲現(xiàn)象：

電場中，液體相對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)；（8）支持物篩孔大?。?/p>

孔徑小，電泳速度慢，反之則快。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。這種凝膠是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基團(tuán)體系時(shí)，就會(huì)聚合。引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種：（1）化學(xué)法（2）光聚合法。

3、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

（1）化學(xué)聚合：

引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化AP產(chǎn)生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺單體形成單體長鏈?；瘜W(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復(fù)性好，用來制備分離膠；（2）光聚合：光聚合法的催化劑是核黃素（VB2），光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。

■

聚合反應(yīng)：架橋物造成分枝端點(diǎn)自由基可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯(cuò)連結(jié)自由基形成（1）聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；（2）鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；（3）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有抗對(duì)流的作用；（4）長鏈富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；（5）該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。

4、聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)：（1）凝膠度：是指100mg凝膠溶液中含有單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）的總克數(shù)，用T%表示。（2）交聯(lián)度：

是指凝膠溶液中，交聯(lián)劑（Bis）占單體（Acr）和交聯(lián)劑（Bis）總量的百分?jǐn)?shù)，用C%表示。一般濃縮膠的濃度為7.5%，分離膠的濃度為10%。

5、凝膠的質(zhì)量決定因素：（1）三個(gè)不連續(xù)性的表現(xiàn)：①凝膠由上下兩層組成，兩層凝膠的孔徑不同；②緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同；③在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。

6、不連續(xù)PAGE的原理：不連續(xù)PAGE電泳膠體系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層

(負(fù)極)緩沖液2

樣本溶液3濃縮膠

6.7

4分離膠5下層

(正極)緩沖液

Tris-HClTris-HClTris-glycine

Tris-HClTris-glycine

8.3

8.0

8.98.3

5%

7%

-

-

-

(2)不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)：

①電荷效應(yīng)：酶蛋白按其所帶電荷的種類及數(shù)量，在電場作用下向一定的電極以一定的速度泳動(dòng)。

②分子篩效應(yīng):

相對(duì)分子質(zhì)量或構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時(shí)，所受摩擦不同，受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的遷移率。③濃縮效應(yīng):使待分離樣品中的各組分在濃縮膠中被壓縮成層。

★濃縮效應(yīng)產(chǎn)生的原因：（1）兩層膠的孔徑不同:酶蛋白向下移動(dòng)到兩層凝膠界面時(shí)，阻力突然加大，速度變慢。這樣，就在兩層凝膠交界處使待分離的酶蛋白區(qū)帶變窄，濃度升高。（2）濃縮膠中產(chǎn)生不連續(xù)的電位梯度:在聚丙烯酰胺凝膠中用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠的pH為6.7，下層分離膠的pH為8.9。HCl為強(qiáng)電解質(zhì)，不管在哪層膠中幾乎全部電離，Cl布滿整個(gè)膠,待分離的酶蛋白加在點(diǎn)樣孔，浸在pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，有效泳動(dòng)率最大的Cl迅速跑到最前面，成為快離子，在pH為6.7條件下解離度僅有0.1－1％的甘氨酸有效泳動(dòng)率最低，跑到最后面，成為慢離子，這樣在，快慢離子之間就形成一個(gè)不斷移動(dòng)的界面。在pH為6.7條件下帶有負(fù)電荷的酶蛋白，其有效泳動(dòng)率介于快慢離子之間，被夾持分布在界面附近，逐漸形成一個(gè)區(qū)帶。

■在濃縮膠中的三個(gè)主要作用角色：甘氨酸:pH=8.9負(fù)電荷pI=5.96不帶電荷Cl-1:蛋白質(zhì)(酶):小分子大分子■濃縮效應(yīng)：分離膠濃縮膠樣本8.96.7離子缺乏空間ABC++8.0V=I/S1、實(shí)驗(yàn)材料：小麥幼苗2、儀器、器皿：(1)垂直板電泳裝置（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）；(2)穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；（3）高速冷凍離心機(jī)；（4）電子天平；（5）電冰箱；（6）瓷盤、微量進(jìn)樣器；三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：

3、試劑：

（1）1NHCl：用12N的濃鹽酸來配制；（2）分離膠緩沖液（pH8.9的Tris-HCl緩沖液）：（3）濃縮膠緩沖液（pH6.7Tris-HCl緩沖液）：（4）分離膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液Ⅰ）：（5）濃縮膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液Ⅱ）：（6）過硫酸銨溶液（NH4）2S2O8簡寫Ap：（當(dāng)天配制）；（7）核黃素溶液：（8）電極緩沖液：（pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液）（9）40%蔗糖：

（10）pH4.7乙酸緩沖液：（11）樣品提取液：（12）0.5%的溴酚藍(lán)：0.5g溶于100ml無離子水；

（13）過氧化物酶同工酶聯(lián)苯胺染色液：1g聯(lián)苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用時(shí)加160ml水,加Vc140.8mg,加幾滴30%過氧化氫原液。聯(lián)苯胺是致癌物質(zhì)，稱取時(shí)應(yīng)戴手套；

1、貯液的配制：2、凝膠的制備：

2.1膠板的制備：2.2分離膠的制備：2.3濃縮膠的制備：3、酶液的制備：4、裝槽、點(diǎn)樣：5、電泳：6、剝膠、固定、染色：

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

2.1膠板的制備：

2.2分離膠的制備：

按下表制備分離膠試劑名稱分離膠緩沖液分離膠丙膠貯液Ap無離子水體積比1241取用量（ml）36123

膠灌至距梳子齒下端1cm

→灌畢→封上一層水加速聚合→當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。

2.3濃縮膠的制備：

按下表制備濃縮膠

試劑名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠丙膠貯液Ap蔗糖體積比1222取用量