生物化學教學課件：胰蛋白酶(trpsin ) 米氏常數(shù)的測定

胰蛋白酶(trpsin)米氏常數(shù)的測定

胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶。由牛、羊、豬胰臟提取而得的一種肽鏈內(nèi)切酶，只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。白色或米黃色結晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pI～10.8，最適pH值7.8～8.5左右。在pH為3時最穩(wěn)定，pH>9.0不可逆失活。Ca2+對酶活性有穩(wěn)定作用；重金屬離子、有機磷化合物、天然胰蛋白酶抑制劑對其活性有強烈抑制。臨床用于抗炎消腫，工業(yè)上用于皮革制造、生絲處理、食品加工等。酶促反應速度：酶促反應體系復雜，影響酶促反應速度的因素很多，包括底物濃度、酶濃度、產(chǎn)物濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等影響因素。酶促反應速度通常用在一定條件下，以單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示，用產(chǎn)物濃度對反應時間作圖，得到酶促反應速度曲線。

酶活力的測定酶活力的測定一般是通過測定酶促反應的速度而確定，而酶催化的反應速度可用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增加量或底物的減少量來表示。測定方法主要是根據(jù)產(chǎn)物或底物的物理化學特性來決定具體的測定方法，分光光度法具有操作簡便，時間短，靈敏度高等優(yōu)點，是一種最重要的酶活力的測定方法。本實驗采用L-BAPA(苯甲酰-L-精氨酸-對硝基苯胺）作為酶的底物，分光光度法記錄酶促反應生成產(chǎn)物對硝基苯胺引起的光吸收增加值，通過在410nm連續(xù)測定反應過程中產(chǎn)物光吸收值的變化，做出光吸收—時間曲線，從而計算出酶促反應速度。

底物濃度對酶促反應的影響在酶濃度，pH，溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應速度的關系。如右圖所示：在低底物濃度時,反應速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級反應特征。當?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的酶都與底物結合后，反應速度達到最大值（Vmax），此時再增加底物濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應。1）米氏方程1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說對酶促反映的動力學進行研究，推導出了表示整個反應中底物濃度和反應速度關系的著名公式，稱為米氏方程。Km—

米氏常數(shù)Vmax—

最大反應速度2）米氏常數(shù)的意義:由米氏方程可知，當反應速度等于最大反應速度一半時,即V=1/2Vmax,Km=[S]

上式表示,米氏常數(shù)是反應速度為最大值的一半時的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法—

雙倒數(shù)作圖法。

1Km11

=

+

V

Vmax[S]Vmax取米氏方程式的倒數(shù)形式：1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km3）米氏常數(shù)求法實驗步驟測活體系：室溫條件下測定.調(diào)好分光光度計，取兩個10mm比色杯,測定波長為410nM。加入測活緩沖液50mMTris-HCl

10mMCaCl2(pH8.2)，加入不同濃度的底物，最后加入100ultrpsin使終體積為3mL。空白對照除不加酶，其它都相同?；靹蚝?，立刻計時，并測定A410nm,每個底物濃度至少記錄6個時間點。即5個?A410nm/min,作圖，斜率即為該底物濃度下的反應初速率。

共六個實驗組，即六個不同底物濃度，分別測定