高效液相色譜法測(cè)定腦脈康中的超聲波濃度

高效液相色譜法測(cè)定腦脈康中的超聲波濃度

0,5-二硝基苯甲酰氯的檢測(cè)這種片劑通常用于測(cè)定內(nèi)外關(guān)節(jié)疼痛的功能。由于婆羅西亞植物結(jié)構(gòu)中沒(méi)有具有紫色表面處理功能，因此主要采用膜色譜法和液相色譜法。高效液相色譜法是實(shí)驗(yàn)室中常見的分析性實(shí)驗(yàn)室藥物，用于分離和測(cè)定一般中藥成分，但很難直接分析具有較弱紫外吸收能力的化合物。根據(jù)該化合物的特點(diǎn)，3.5-二硝基苯磺酸鹽可用作此類化合物的衍生物試劑。在叔胺和吡啶的化合物作用下，它可以與鈣化后的三、五-二硝基苯丙烯酸酯反應(yīng)，形成具有強(qiáng)烈紫外吸收的三、五-二硝基苯丙烯酸酯。我們利用這一原則，利用反相hplc法對(duì)腦脈康中的婆羅西亞劑量進(jìn)行了測(cè)定和研究。1材料和方法1.1保元酸溶液、5-二硝基苯甲酰氯及dnb-cl高效液相色譜儀配備紫外檢測(cè)器(日本島津LC-10Avp),色譜柱:KromasilC18150.0mm×4.6mm,5μm(大連伯瑞公司填充).冰片對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)743-8902),溶于乙腈中制成濃度為1mmol·L-1的溶液;3,5-二硝基苯甲酰氯(DNB-Cl,北京化工廠),溶于乙腈中制成濃度為5mmol·L-1的溶液;4-二甲氨基吡啶(DMAP,Sigma公司),溶于乙腈中制成濃度為40mmol·L-1的溶液.3,5-二硝基苯甲酸冰片酯(自制,mp:148~150℃),乙腈(色譜純),甲醇(分析純).腦脈康腸溶膠囊(自制,批號(hào)20010319,20010426).1.2方法1.2.1條件1以甲醇:水(88:12)為流動(dòng)相,流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)225nm,進(jìn)樣體積5μL的色譜圖(Fig1).1.2.2在sec中，原材料反應(yīng)的溫度和時(shí)間的研究經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度(20~80℃)對(duì)衍生反應(yīng)無(wú)明顯影響.在室溫下,混合2min后衍生反應(yīng)即可完成.1.2.3dnb-cl與血清摩爾比的確定將冰片和DMAP用量固定,改變衍生化試劑DNB-Cl的用量(Fig2).實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)DNB-Cl與冰片的摩爾比(nDNB-Cl/nborneol)為35倍時(shí),衍生物相對(duì)色譜峰面積最大,但放置穩(wěn)定性稍差,而摩爾比為20倍時(shí)放置穩(wěn)定性較好,因此正式實(shí)驗(yàn)選擇DNB-Cl與冰片的摩爾比為20倍.1.2.4dmap與血清摩爾比對(duì)ndap衍生物相對(duì)色譜峰穩(wěn)定性的影響將冰片和DNB-Cl用量固定,改變催化劑DMAP的用量(Fig3).實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)DMAP與冰片的摩爾比(nDMAP/nborneol)為20倍時(shí),衍生物相對(duì)色譜峰面積最大,而摩爾比為40倍時(shí),適應(yīng)范圍較寬,因此正式實(shí)驗(yàn)選擇DMAP與冰片的摩爾比為40倍.1.2.5衍生化方法的制備定量吸取冰片對(duì)照品溶液100μL置具塞試管中,加入400μLDNB-Cl溶液,再加入100μLDMAP溶液混勻,即得.精密稱取腦脈康藥粉約42mg于25mL容量瓶中,加適量乙腈,旋渦振蕩,加乙腈至刻度,混勻,轉(zhuǎn)入離心管中離心(14000g·min-1)5min,取100μL同對(duì)照品溶液衍生化制備方法進(jìn)行.2結(jié)果2.1色譜峰面積與進(jìn)樣量的關(guān)系分別精密吸取對(duì)照品溶液的衍生化溶液1,2,3,4,5,6,7,8,9和10μL注入色譜儀,以進(jìn)樣體積(X)對(duì)色譜峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:Y=-14.6+82796.4X,R2=0.9996(P<0.01).因此在1~10nmol范圍內(nèi),冰片衍生物色譜峰面積與進(jìn)樣量成正相關(guān).2.2加標(biāo)回收率和rsd精密稱取已知含量的腦脈康藥粉適量,加入一定量的對(duì)照品溶液,按“1.2.5”項(xiàng)下處理,測(cè)定含量,計(jì)算腦脈康中冰片的回收率為99.9%,RSD為1.8%(n=4).2.3含量檢測(cè)將對(duì)照品和供試品衍生化后溶液各5μL分別注入色譜儀,測(cè)定峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算,測(cè)得兩批腦脈康中冰片的含量分別為7.9%和7.1%,RSD分別為1.0%和1.5%(n=5).3衍生化試劑的制備冰片是一味常用的中藥,有合成和天然之分,主要成分是互為異構(gòu)體的龍腦和異龍腦.其化學(xué)結(jié)構(gòu)無(wú)特征紫外吸收,無(wú)法直接用實(shí)驗(yàn)室常見分析儀器高效液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定,因此采用衍生化HPLC法是測(cè)定這類化合物較好的方法.冰片結(jié)構(gòu)中含羥基,而3,5-二硝基苯甲酰氯是羥基化合物常用的衍生化試劑,在叔胺或吡啶類化合物的催化下可和冰片反應(yīng)生成3,5-二硝基苯甲酸冰片酯,該新化合物具有較強(qiáng)的紫外吸收,龍腦和異龍腦在此色譜條件下顯示為單峰,從而利用柱前衍生化反相HPLC法間接完成了腦脈康中冰片含量的測(cè)定研究.實(shí)驗(yàn)中曾使用三乙胺作為催化劑,發(fā)現(xiàn)即使升高反應(yīng)溫度,三乙胺對(duì)衍生反應(yīng)的催化作用也較弱.使用乙腈作衍生反應(yīng)和提取溶劑,需注意其含水量的大小,如含水分大,需經(jīng)脫水處理.冰片的DNB-Cl衍生物3,5-二硝基苯甲酸冰片酯在225nm處有很強(qiáng)的紫外吸收,因此選擇225nm為檢測(cè)波長(zhǎng).在本文的色譜流動(dòng)相和流速條件下,出峰時(shí)間為5min左右,較合適于樣品的快速測(cè)定.在所選擇的DNB