瓊產(chǎn)艾納香葉精油的gc-ms分析

瓊產(chǎn)艾納香葉精油的gc-ms分析

蜂蜜是純度、復(fù)雜、富含香味的植物精華成分。它通常具有抗菌、抗炎、止癢、安神等功能，并在醫(yī)藥、食品、護理和口腔護理行業(yè)應(yīng)用。艾納香(Blumeabalsamifera(L.)DC.)為菊科(Asteraceae)植物,廣泛分布于中國貴州、云南、廣西、海南以及東南亞多個國家。艾納香在中國南方作為傳統(tǒng)民族草藥已有悠久歷史,醫(yī)書記載艾納香具有治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、產(chǎn)后痛風(fēng)、濕疹、皮炎等疾病。在東南亞,艾納香常被用來熏蒸沐浴,添加到煙草和茶飲料中,并作為草藥用于緩解產(chǎn)后痛風(fēng)及防治皮膚病等。艾納香精油在民間被認為是艾納香的精華所在,因其獨特香氣和記載的藥用作用(消炎、消腫、止痛等)受到香精香料和醫(yī)療美容及化妝品行業(yè)親睞。目前,中國、孟加拉和泰國的多位學(xué)者研究了中國貴州、云南、廣西和泰國、孟加拉產(chǎn)艾納香揮發(fā)油的化學(xué)組成和抗菌及驅(qū)蟲活性。這些學(xué)者多研究艾納香揮發(fā)油,Bhuiyan等利用Clevenger裝置提取泰國和孟加拉產(chǎn)艾納香葉精油,并分析其化學(xué)組成。我國的海南島因氣候環(huán)境適宜艾納香生長,全島廣泛分布,蘊藏量豐富,海南也成為即貴州之后又一個重要的艾納香產(chǎn)地。本研究利用GC-MS分析瓊產(chǎn)艾納香葉精油的化學(xué)組成,通過DPPH自由基清除試驗、β-胡蘿卜素漂白試驗和硫代巴比妥酸法研究其抗氧化活性,通過抑菌圈和最小抑菌濃度2個指標(biāo)考察其抗菌活性。1材料和方法1.1化學(xué)試劑及儀器艾納香葉,采自海南省五指山,自然陰干進行破碎處理得干艾納香葉粉末;金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、大腸桿菌、沙門氏菌、假絲酵母、黃曲霉,均購于廣東省微生物研究所;DPPH、正己烷(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司;C8-C22正構(gòu)烷烴,美國Accustand公司;TBHQ、Ve、Vc、β-胡蘿卜素、亞油酸、吐溫40、AAPH、硫代巴比妥酸、十二烷基磺酸鈉、慶大霉素、酵母浸膏、牛肉膏蛋白胨、葡萄糖、NaCl、瓊脂條等,均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。SW-CJ-2C超凈工作臺,蘇州凈化設(shè)備廠;Varian1200LGC/MS-MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Varian公司;DB-5彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm,0.25μm),美國Agilent公司。1.2實驗方法1.2.1精油的提取稱取50g艾納香葉粉末,置于2L蒸餾瓶中,再加入1L蒸餾水,使用Clevenger氏裝置通過水蒸氣蒸餾法提取精油,蒸餾6h后收集裝置中的油相。以上試驗重復(fù)8次,將每次收得的精油集中并加入無水硫酸鈉進行干燥,過濾后得到具有濃郁香氣的艾納香葉精油,得率為0.62%。1.2.2萃取條件及質(zhì)譜將提取的艾納香葉精油溶解于正己烷(色譜純),配置成濃度為200μg/mL待測樣,利用GC-MS對其進行分析,確定其主要化學(xué)成分及其相對含量。升溫程序,初溫40℃保持1min,然后以5℃/min升至280℃,保持5min;進樣口溫度250℃;載氣(He)流速1.0mL/min。萃取頭在進樣口于250℃解析3min。質(zhì)譜條件,電子轟擊離子源(EI),離子源溫度200℃,電子能量70eV,發(fā)射電流35μA,檢測器電壓1000V,接口溫度280℃,掃描質(zhì)量范圍50~500amu?；衔锒ㄐ圆捎帽Ａ糁笖?shù)和質(zhì)譜圖對照2種方法?；衔锏谋Ａ糁笖?shù)是根據(jù)其保留時間與C8-C22正構(gòu)烷烴的保留時間按照保留指數(shù)計算公式計算而得;采集到的質(zhì)譜圖與NIST和Wiley標(biāo)準(zhǔn)譜庫對照,對組分定性,僅報道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鑒定結(jié)果。用峰面積歸一法計算各化學(xué)成分的相對含量。1.2.3艾納香葉蠟的抗逆性1.2.3.dpph乙醇溶液配制通過DPPH自由基清除率表現(xiàn)艾納香葉精油的抗氧化活性。配制濃度分別為1、2、4、6、8、10、15、20和40g/L的受試樣品乙醇溶液。分別取1mL受試品溶液與2mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液混合,立刻于517nm處測定吸光度,在避光處靜置1h,再測吸光度,不加樣的DPPH乙醇液為空白樣。實驗平行測定3次。自由基清除率按下式計算:式中:AC(0),t=0時的空白吸光度,AC(t),測試樣在t=1h時的吸光度。1.2.3.抗氧化能力的測定將0.1mgβ-胡蘿卜素用10mL三氯甲烷于圓底瓶中溶解,加入20mg亞油酸和100mg吐溫40,然后于50℃旋轉(zhuǎn)真空干燥。加入50mL含氧蒸餾水,在超聲波中形成乳化液A。取200μL濃度分別為0.1,0.5,1,2,4,6和8g/L的受試樣品乙醇液與5mL乳化A液于試管中混合,等量乙醇代替作為空白樣。在50℃保溫,于470nm測定吸光度。測定平行3次?？寡趸视孟率接嬎?。式中:AA(120),測試物在t=120min時的吸光度,AC(120),空白在t=120min是的吸光度,AC(0),空白在t=0min時的吸光度。1.2.3.抗氧化指數(shù)測定方法分別取0.1mL濃度為10,20,40g/L的樣品乙醇液與0.5mL蛋黃乳濁液混合,加入0.05mL的AAPH自由基溶液(0.07mol/L)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。隨后即加入1.5mL乙酸溶液(20%,pH3.5)和1.5mL濃度為0.8%硫代巴比妥酸液(用11g/L)十二烷基硫酸鈉溶液配制),振蕩均勻。不加精油樣品的為空白樣。然后于95℃水浴保持60min。冷卻后,每個試管中加入5mL正丁醇,充分萃取,于1200g離心15min。傾出有機層在532nm處測定吸光度值。測定平行3次?？寡趸笖?shù)AI用下式計算。式中:AC,完全氧化空白的吸光度,AT,測試樣品的吸光度。1.2.4艾納香葉蠟的抗菌活性研究1.2.4.菌種培養(yǎng)及培養(yǎng)將受試細菌菌株按1∶100接種活化,在固體LB培養(yǎng)基上劃線,37℃培養(yǎng)24h后,挑取單個菌落,接種到液體培養(yǎng)基上震蕩培養(yǎng)18h。采用麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕河靡后w培養(yǎng)基稀釋到合適濃度,本實驗中菌液濃度為106CFU/mL。將受試真菌菌株用液體SDA培養(yǎng)基使菌種融化分散,30℃培養(yǎng)24h,在SDA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)48~72h。將孢子刮入吐溫80生理鹽水溶液作為母液,調(diào)整濃度為106CFU/mL。1.2.4.抑菌圈直徑測定濾紙片(6mm)經(jīng)滅菌后,分別點上5μL精油DMSO溶液,無菌條件下貼在涂有菌液的固體培養(yǎng)基上,并用DMSO做空白對照,細菌在37℃下培養(yǎng)24h后測抑菌圈直徑,真菌在30℃下培養(yǎng)48~72h后測抑菌圈直徑,每種受試物6次重復(fù)。1.2.4.最小抑菌濃度測定用固體培養(yǎng)基以二倍稀釋法對精油進行梯度稀釋,稀釋成13個2倍系列濃度,最后一平皿不加精油作為陰性對照,并用DMSO做空白對照。最后點上配置的菌懸液。細菌在37℃下培養(yǎng)24h,真菌在30℃下培養(yǎng)48~72h,無明顯菌落生長的平皿的精油濃度即為精油的最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)。試驗平行3次。2結(jié)果與分析2.1gc-ms精油聯(lián)合GC-MS技術(shù)對艾納香葉精油進行分析,通過質(zhì)譜庫檢索和保留指數(shù)比對分析,檢出精油的成分組成見表1。初步定性組分45種,其中有37種屬于萜類化合物,單萜19種(48.55%),倍半萜18種(39.91%)。在單萜中,萜烯種類最多,共10種(8.65%);萜醇相對含量最高,6種總含量達29.95%;其他依次為萜酮2種(9.64%),萜酯1種(0.31%)。在倍半萜中,萜烯種類最多,共10種,相對含量也最高,達到37.59%;另一類是萜醇8種(2.32%)。圖1為精油的GC-MS總離子圖。精油的相對含量前5位的組分分別是(-)-龍腦(28.45%)、石竹烯(22.98%)、樟腦(9.56%)、α-蓽澄茄烯(8.32%)和β-蒎烯(4.32%)。這些組分賦予了艾納香葉精油濃郁的中藥香氣,主體表現(xiàn)為樟腦香和草藥香氣。目前已有多個產(chǎn)地的艾納香揮發(fā)油或精油的化學(xué)成分報道,如貴州羅甸產(chǎn)艾納香揮發(fā)油主要含有(-)-龍腦(57%)、石竹烯(8%)和樟腦(5%);廣西南寧產(chǎn)艾納香精油主要成分是(-)-龍腦(12%)、1,8-桉葉醇(20%)、石竹烯(10%)和樟腦(8%);云南普洱產(chǎn)艾納香揮發(fā)油主要成分是(-)-龍腦(52%)和樟腦(18%);泰國產(chǎn)艾納香精油主要成分是(-)-龍腦(25%)和樟腦(20%);孟加拉產(chǎn)艾納香精油的主要成分是(-)-龍腦(33%)、石竹烯(8%)、喇叭茶醇(7%)和氧化石竹烯(4%)。本研究中瓊產(chǎn)艾納香葉精油與以上多個產(chǎn)地的艾納香揮發(fā)油或精油比較后發(fā)現(xiàn),瓊產(chǎn)艾納香葉精油中(-)-龍腦相對含量依然是最高的,但并未超過半數(shù),而其石竹烯、α-蓽澄茄烯和β-蒎烯的相對含量都是其他揮發(fā)油或精油所不具備的高含量,這說明瓊產(chǎn)艾納香葉精油具有主要成分豐富的特點,也可能給其帶來獨特的活性特征。這些組分已經(jīng)被報道具有抗氧化和抗菌的等活性,艾納香葉精油也可能具有這類活性,下面就對艾納香葉精油的抗氧化和抗菌活性進行初步研究。2.2瓊產(chǎn)艾納香葉精油清除dpph自由基能力的檢測抗氧化物主要通過兩種機制清除自由基,即氫原子轉(zhuǎn)移(HAT)和電子轉(zhuǎn)移(SET)。沒有某種單一的測試方法足以評價樣品的抗氧化活性,所以需要多種方法應(yīng)用于樣品的抗氧化試驗中。通過DPPH自由基清除試驗、β-胡蘿卜素漂白試驗和硫代巴比妥酸法研究瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抗氧化活性,同時與商業(yè)化抗氧化劑水溶性Vc、VE、TBHQ比較效果。DP-PH自由基是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基,DPPH自由基清除能力是一種最常見的衡量化合物抗氧化活性指標(biāo),廣泛應(yīng)用于定量測定生物樣品和食品等物質(zhì)的抗氧化能力。DPPH自由基清除實驗屬于SET類方法,DPPH自由基有單電子,當(dāng)有自由基清除劑存在時,與其單電子配對而使褪色,褪色程度與其接受電子的數(shù)量成線性定量關(guān)系,因而可用分光光度計快速定量分析。由圖2可知,艾納香葉精油對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強,在1~20mg/mL濃度內(nèi)成線性關(guān)系。從表2發(fā)現(xiàn),Vc、VE和TBHQ3種商業(yè)化的強抗氧化劑的DPPH自由基清除能力很高,而且效果接近,IC50在11~14μg/mL;而瓊產(chǎn)艾納香葉精油對DPPH自由基清除率的IC50為11.26mg/mL。精油的DPPH自由基清除能力與強抗氧化劑相比效果差距巨大,但是也表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性,可推測電子轉(zhuǎn)移作用機制不是其抗氧化作用的主要機制。β-胡蘿卜素漂白(BCB)試驗主要是評價抗氧化物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中抑制脂質(zhì)氫過氧化前期的能力,屬于HAT類方法。圖3為采用β-胡蘿卜素漂白法測定的瓊產(chǎn)艾納香葉精油抗氧化活性。表2為幾種抗氧化物活性的比較,在脂質(zhì)體系中醇溶性的VE是公認的強抗氧化劑,在本試驗條件下,VE再現(xiàn)出極強的抗氧化性,其半抑制濃度IC50約為0.017g/L。但是作為強抗氧化劑的水溶性Vc幾乎不顯現(xiàn)其抗氧化活性,未能測出其IC50值。這種現(xiàn)象稱為脂質(zhì)體系中的“極性反?！?polarpara-dox),其原因是由于水溶性極性物質(zhì)在乳化脂質(zhì)體系中主要集中在水相,而脂相中的濃度極低。瓊產(chǎn)艾納香葉精油在高濃度時也表現(xiàn)出較好的抑制β-胡蘿卜素漂白的活性,IC50約為3.55g/L。與2種強抗氧化劑比較發(fā)現(xiàn),精油的IC50值與強抗氧化劑之間的差距較DPPH自由基清除試驗縮小,說明精油在脂質(zhì)體系中表現(xiàn)出更強的抗氧化活性。硫代巴比妥酸法(TBARS)主要衡量的是抗氧化劑清除能導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的自由基的能力,同時也能衡量弱親脂性抗氧化劑的抗氧化能力,屬于HAT類方法,此法也被認為是最接近真實環(huán)境的測試方法。由于水溶性抗氧化劑會出現(xiàn)“極性反常”現(xiàn)象,所以該法僅對瓊產(chǎn)艾納香葉精油和脂溶性的VE、TBHQ進行測試。如表3所示,精油和其他抗氧化劑的抗氧化指數(shù)均隨受試濃度的升高而上升,同時還發(fā)現(xiàn)精油與VE和TBHQ的差距并未表現(xiàn)出DPPH和BCB試驗中巨大的差距。精油表現(xiàn)出的抗氧化活性主要來源于其中萜烯類化合物,如石竹烯等。從3個測試結(jié)果看,精油抗氧化作用機制主要是氫原子轉(zhuǎn)移作用,電子轉(zhuǎn)移作用較弱。雖然精油的抗氧化能力與公認的強抗氧化劑仍存在差距,但是TBARS結(jié)果說明瓊產(chǎn)艾納香葉精油在接近真實環(huán)境的體系中表現(xiàn)出了較強的抗氧化能力?？梢哉J為瓊產(chǎn)艾納香葉精油作為一種純天然產(chǎn)物,具有成為保健食品和化妝品等高檔產(chǎn)品中天然抗氧化添加劑的潛力。2.3不同品種植物精油的抑菌活性植物精油普遍表現(xiàn)出了抗菌性能,但是不同精油對不同菌種的抑制能力存在差異,需要做詳細的研究。選用2種革蘭氏陽性細菌,2種革蘭氏陰性細菌和2種真菌作為測試菌,通過抑菌圈和最小抑菌濃度(MIC)2個指標(biāo)對瓊產(chǎn)艾納香葉精油的抑菌活性進行初步研究。由表4可知,比較抑菌圈發(fā)現(xiàn)精油對革蘭氏陽性細菌的抑制效果明顯好于陰性細菌,對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強。對真菌的抑制效果略強于細菌,對假絲酵母的抑制能力稍強于黃曲霉。比較MIC發(fā)現(xiàn)精油對真菌的抑制能力明顯強于細菌,2種真菌的MIC都是625μg/mL,對金黃色葡萄球菌抑制效果較好(625μg/mL),對其他3種細菌的抑制能力相對較弱(2500μg/mL)。據(jù)泰國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),泰國產(chǎn)艾納香精油對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌都沒有表現(xiàn)出抑菌活性,僅對革蘭氏陽性菌蠟樣芽孢桿菌(MIC:0.15mg/mL)和金黃色葡萄球菌(MIC:1.2mg/mL)