廣西莪術(shù)揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms指紋圖譜對藥效貢獻的研究

廣西莪術(shù)揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms指紋圖譜對藥效貢獻的研究

廣西莪術(shù)是2010年版《中國藥典》中收集的三種基原茂分術(shù)（curcumapha相應的生長和轉(zhuǎn)化）的一種，即c.k胡說八道。etc.f.liang和wenyunikc.wenyunik）中的一種。這是姜科江黃種植物的干燥生根。莪術(shù)的主要有效部位為根和根莖,揮發(fā)油是莪術(shù)的主要活性成分。文獻報道莪術(shù)油具有抗癌、抗凝血、抗氧化和保肝等作用,其中莪術(shù)醇、β-欖香烯、莪術(shù)酮、莪術(shù)二酮是莪術(shù)的主要抗腫瘤活性成分。目前對于莪術(shù)的質(zhì)量評價多以化學成分為評價標準,沒有將化學成分組或者“有效組分群”與藥效結(jié)合起來,而中藥藥效物質(zhì)基礎具有整體性、模糊性的特征,是有效物質(zhì)群綜合效應結(jié)果。因此,本文在已發(fā)表的廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜基礎上,通過體外實驗,研究莪術(shù)油對鼻咽癌細胞CNE-2的生長抑制作用,尋找與莪術(shù)抗腫瘤作用相關(guān)的“有效組分群”,尋找不同產(chǎn)地的廣西莪術(shù)揮發(fā)油與化學特征指紋峰之間的關(guān)系,以闡明廣西莪術(shù)抗腫瘤的藥效物質(zhì)基礎。1材料表面1.1儀器、試驗裝置5973N-6890型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司),色譜柱HP-5MS毛細管柱(美國Agilent公司);FA1004型電子天平(海精科天平儀器廠),調(diào)溫加熱器(上海電理儀器廠),ThermoCO2孵箱(美國Thermoscientificcompany),Olympus倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),Bio-TEK酶標儀(美國Bio公司),電泳槽(美國Bio-RAD公司),GENIUS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。1.2細胞培養(yǎng)基Hochest33342(凱基生物公司),四唑鹽(MTT)(美國Amresco公司)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司),細胞培養(yǎng)基PRMI1640(Gibco公司),胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司),一抗及二抗(北京中衫金橋生物公司),其余均為國產(chǎn)分析純。CNE-2細胞株為本科學實驗中心傳代保株。1.3樣品采集和儲藏廣西莪術(shù)樣品分別于2007年1月采自靈山、貴港、橫縣3個主產(chǎn)區(qū),其中靈山共采4批次、貴港和橫縣各采3批次,共計10個批次,樣品編號依次為1~10。樣品采收后洗凈、切片、曬干、打碎,過20目篩,干燥器儲藏備用。所有樣品經(jīng)本教研室鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)C.kwangsiensisS.G.LeeetC.F.Liang。2方法和結(jié)果2.1廣西桂術(shù)揮發(fā)油gc-ms指紋譜2.1.1掃描溫度lmHP-5MS毛細管柱(0.25μm×250μm×30.0m),載氣為高純氦氣,流速1.0mL·min-1,進樣量1μL,程序升溫:65℃恒溫2min,65~90℃(5℃·min-1)恒溫3min,90~103℃(20℃·min-1)恒溫3min,103~150℃(8℃·min-1)恒溫15min,150~280℃(20℃·min-1);不分流,進樣溫度250℃,進樣量1μL,倍增器電壓1435V,接口溫度280℃,離子源溫度230℃,電離方式EI;電子能量70.1eV;溶劑延遲3min,掃描質(zhì)量范圍m/z45~550。在此色譜條件下,各特征能有效分離。2.1.2gc-ms指紋色譜根據(jù)2005年版《中國藥典》一部附錄XD法提取樣品揮發(fā)油和測定出油率,提取的10批次樣品揮發(fā)油分別用無水硫酸鈉除去水分,然后置于100mL量瓶中,加乙醚定容至刻度,0.45μm微孔濾膜過濾,即得。取各供試品溶液10μL,按上述色譜條件進行GC-MS分析,得到GC-MS指紋色譜圖(圖1)。圖譜經(jīng)計算機譜檢索及人工解析研究其化學結(jié)構(gòu),比較10批樣品色譜圖后,從中選定20個共有峰指紋峰構(gòu)成廣西莪術(shù)指紋圖譜的穩(wěn)定特征峰,選擇14號峰β-欖香烯為內(nèi)參峰(S峰),以其保留時間和峰面積為1,分別計算各特征峰的調(diào)整保留時間之比(α值)和相對峰面積(峰面積之比),結(jié)果見表1。2.2細胞內(nèi)表達pmi-1330將提取干燥的10批次莪術(shù)油30mg,溶于3mL無水乙醇中,莪術(shù)油的初始質(zhì)量濃度為10g·L-1。實驗中用含12%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將莪術(shù)油稀釋為100.0mg·L-1的濃度給藥,陰性對照組為10mL·L-1的無水乙醇培養(yǎng)基。取對數(shù)生長期的CNE-2細胞,接種于96孔板,細胞貼壁后加入藥物。于加藥后48h取出板,每孔加入20μLMTT溶液,4h后吸出上清液,加入150μLDMSO,震蕩10min,在酶標儀上于490nm處測定對照組及加藥組的吸光度(A),結(jié)果見表2。2.3關(guān)聯(lián)度分析根據(jù)文獻方法計算廣西莪術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜特征與藥效作用之間的灰關(guān)聯(lián)度及關(guān)聯(lián)序。本研究將不同批次的廣西莪術(shù)揮發(fā)油對腫瘤細胞的增殖抑制率設為參考序列(母序列),比較數(shù)列(子序列)為20個特征峰,1~20號特征峰分別用x1~x20表示。將母序列與子序列進行灰色關(guān)聯(lián)度分析,依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小,確定了各特征成分對抗腫瘤作用貢獻的大小順序為:莪術(shù)醇>莪術(shù)二酮>β-欖香烯>吉馬酮>莪術(shù)酮>α-丁子香烯>δ-瑟林烯>β-石竹烯>β-欖香烯酮>a-蒎烯>α-石竹烯>桉油素>樟腦>2-壬醇>異龍腦莪術(shù)烯>δ-欖香烯>莰烯>D-檸檬烯>龍腦。結(jié)果表明廣西莪術(shù)抗腫瘤作用是其內(nèi)“有效組分群”共同作用的結(jié)果,各特征峰代表的化學成分與其增殖抑制作用的關(guān)聯(lián)度雖大小不一,但都起了一定的作用。結(jié)果見表3。3指紋圖譜技術(shù)的應用指紋圖譜相似度評價方法是國家中醫(yī)藥管理局認可的用來判斷中藥化學成分相似性的一種方法。從理論上講,化學指紋圖譜相似度高的藥物,化學成分相似,其藥效也應該相似。但研究發(fā)現(xiàn),10批次廣西莪術(shù)揮發(fā)油的指紋圖譜用相似度評價軟件評價后,在主要特征峰不一致時,仍具有很高的相似度。如在橫縣主產(chǎn)區(qū)的2個批次的樣品中均未檢測到莪術(shù)醇,但GC-MS相似度均達到了0.99以上?？鼓[瘤藥效學研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不含莪術(shù)醇的上述2個批次樣品對腫瘤增殖的抑制作用較低,抑制率僅為8.88%和8.49%。來自貴港的6個批次樣品莪術(shù)醇含量最高,而其對腫瘤增殖的抑制作用大,抑制率98.57%。由此可以看出,不能僅以指紋圖譜相似度評價的方法來推測藥效。灰關(guān)聯(lián)度分析作為對模糊系統(tǒng)研究的有效手段,已被廣泛應用于經(jīng)濟評價、投資決策、環(huán)境檢測、人員考核、項目評估以及機械加工等過程控制與質(zhì)量評價中。大量的研究已證實,上述各領域的研究共同特點是系統(tǒng)的信息量較少,而涉及的因素多,而且這些因素往往是相互影響、相互作者,并非獨立的。目前灰關(guān)聯(lián)度分析應用于對中藥材的質(zhì)量評價研究較少,但其具有既包含有已知信息,又包含有未知信息的特點,通過對其研究可利用已知的信息,去揭示未知的信息,因此更適于含有復化學成分的中藥材的質(zhì)量評價和控制?；诖?本研究通過尋找“有效組分群”的指紋特征與抗腫瘤活性效應之間的聯(lián)系來開展研究,在廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜和藥學效研究的基礎上,獲得了廣西莪術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜20個特征峰面積與對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用的量化數(shù)據(jù),采用灰關(guān)聯(lián)度分析技術(shù),以相對關(guān)聯(lián)