中藥冬蟲夏草-薄荷腦低共熔物對(duì)神經(jīng)毒素納米粒鼻腔給藥吸收入腦的影響

中藥冬蟲夏草-薄荷腦低共熔物對(duì)神經(jīng)毒素納米粒鼻腔給藥吸收入腦的影響

納米藥物載體系統(tǒng)具有許多作用，如靶場(chǎng)、緩沖和保護(hù)藥物。前期實(shí)驗(yàn)表明:納米粒作為神經(jīng)毒素(neurotoxin,NT)的載體,既能保持藥物的活性,又能增加藥物的腦內(nèi)含量。臨床上,NT主要的給藥方式為肌內(nèi)注射,但起效慢(3~5h),難以滿足臨床要求。鼻腔給藥是近年來研究較多的有望成為多肽類藥物注射給藥替代途徑的新型藥物傳輸系統(tǒng)之一。但鼻腔黏膜吸收能力有限且清除較快,因此可以通過加入吸收促進(jìn)劑來提高NT的生物利用度。冰片和薄荷腦是近年來研究較多的中藥吸收促進(jìn)劑。冰片具有“芳香走竄,引藥上行”之效,能有效改善鼻黏膜與血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的通透性,提高藥物腦內(nèi)濃度。薄荷腦具有較強(qiáng)的促滲作用,對(duì)水楊酸等多種藥物具有良好作用。將冰片、薄荷腦制成低共熔混合物可以顯著增加促滲作用,提高藥物療效,減少藥物用量。本課題組前期工作中制備了體外性質(zhì)良好的神經(jīng)毒素納米粒;建立了以微透析技術(shù)為平臺(tái)測(cè)定腦內(nèi)藥物變化的方法,為中藥吸收促進(jìn)劑的篩選與考察奠定了良好的基礎(chǔ)。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)分子和試劑神經(jīng)毒素:中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所蛇毒研究中心(純度≥99%,相對(duì)分子質(zhì)量6700);125I-NT(1.38g·L-1;1.99×108Bq;純度大于99%,標(biāo)記率97%):復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院放射藥學(xué)教研室協(xié)助標(biāo)記和檢測(cè);聚乳酸(PLA):瑞士Fluka公司(相對(duì)分子質(zhì)量25萬;批號(hào)WA18975);冰片:Sigma公司(純度≥8.0%;批號(hào)464-43-7);薄荷腦:Sigma公司(純度≥98.5%,批號(hào)89-78-1)。冰片薄荷腦低共熔物(實(shí)驗(yàn)室自制,即將冰片與薄荷腦以1∶3的比例進(jìn)行研和均勻);泊洛沙姆(pluronic,F68,德國BASF,批號(hào)WPDX5776);戊巴比妥鈉(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號(hào)WS20050711);碘化鉀(寧波市化學(xué)試劑廠,批號(hào)XK13-005-1008-21);飽和碘化鉀溶液:實(shí)驗(yàn)室自制。1.2微透析探針、加標(biāo)劑和冷凍干燥機(jī)SN-695B型智能放免γ測(cè)量?jī)x:上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠;腦微透析儀:美國BAS公司;微透析探針:MD-2200,外徑0.5mm,膜長(zhǎng)2mm,截留相對(duì)分子質(zhì)量為38×103;采用自制鼻腔給藥裝置:專利(專利號(hào)ZL200520013524.0);冷凍干燥機(jī)(LABCONCO,England);JY92-ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。1.3動(dòng)物SD大鼠,雄性,體重(320±20)g,由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。2方法2.1bo/me-nt-nt-np的制備采用實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的制備方法:稱取50mgPLA溶于1.0mL醋酸乙酯中,加入50μL冰片-薄荷腦低共熔物(BO/ME)(冰片組加等量冰片、薄荷腦組加等量薄荷腦、空白組不加),形成有機(jī)相(O),再將50μL1.0g·L-1的NT水溶液(W1)加入到有機(jī)相中,渦旋乳化30s形成初乳溶液(W1/O),將2mL0.5%膽酸鈉水溶液加入到初乳溶液,冰浴下探頭超聲乳化36s(90W)得復(fù)乳溶液(W1/O/W2),復(fù)乳分散到100mL0.5%泊洛沙姆(pluronic,F68)水溶液中,并在真空條件下,40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,最后4萬r·min-1超速離心30min,所得沉淀凍干即得BO/ME-NT-NP。2.2術(shù)后管理和護(hù)理參考LI等方法:SD大鼠戊巴比妥鈉(45mg·kg-1)腹腔注射麻醉,固定于腦立體定位儀上。按大鼠腦圖譜,確定PAG部位(前囟后7mm,腦表面下5mm,中線旁開0.8mm),將腦微透析探針埋植于右側(cè)PAG腹外側(cè)中,固定探針,縫合。術(shù)后5d不予實(shí)驗(yàn),將大鼠放置于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境溫度(22±2)℃;相對(duì)濕度(60±10)%;晝夜12h人工交替;自由飲食和飲水)中生活,作為大鼠手術(shù)后生理恢復(fù)階段。實(shí)驗(yàn)前24h禁食但可自由飲水,并用飽和碘化鉀溶液灌胃(100mg·kg-1)以飽和甲狀腺。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,猝死大鼠,對(duì)大腦進(jìn)行冷凍切片觀察針道,位置不正者,該組數(shù)據(jù)棄去。2.3透析液根據(jù)文獻(xiàn),采用反滲透法測(cè)定腦微透析探針在體回收率。取微透析手術(shù)完成恢復(fù)后的SD大鼠,戊巴比妥鈉(45mg·kg-1)腹腔注射麻醉,俯狀固定于大鼠實(shí)驗(yàn)板上,取出管心針,將微透析探針插入微透析底座中,在大鼠PAG部位用含5,25,50ng·mL-13種不同濃度的125I-NT的灌流液灌流,流速2μL·min-1,收集間隔時(shí)間為15min,總時(shí)間1.5h。第1次和最后1次收集的透析液不作參考。測(cè)定每個(gè)收集時(shí)間點(diǎn)透析液中125I-NT的濃度。在體內(nèi)反透析過程中,由于125I-NT在腦組織中具有較高的擴(kuò)散能力,所以假設(shè)探針周圍腦組織間液(braininterstitialfluid,BIF)中的NT濃度為零(CBIF=0)。體內(nèi)回收率計(jì)算公式:回收率=Cdialysate?CperfusateCperfusate?CBIF×100%(1)Cdialysate和Cperfusate分別為灌流液和透析液中NT的濃度,CBIF為周圍腦組織間液中NT的濃度。2.4實(shí)驗(yàn)大鼠血清中t-np-等神經(jīng)毒素納米粒的檢測(cè),并將nt取SD雄性大鼠20只,隨機(jī)分成四組進(jìn)行鼻腔給藥:添加冰片/薄荷腦低共熔混合物吸收促進(jìn)劑的神經(jīng)毒素納米粒(NT-NP-Ⅰ)、不添加吸收促進(jìn)劑的神經(jīng)毒素納米粒(NT-NP-Ⅱ)、單獨(dú)添加冰片吸收促進(jìn)劑的神經(jīng)毒素納米粒(NT-NP-Ⅲ)、單獨(dú)添加薄荷腦吸收促進(jìn)劑的神經(jīng)毒素納米粒(NT-NP-Ⅳ)(每只大鼠給藥相當(dāng)于NT60μg·kg-1,冰片0.11mg·kg-1,薄荷腦0.38mg·kg-1)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將微透析探針植入微透析底座,探針通過PE管與微量泵相連,30min后,向探針內(nèi)灌注人工腦脊液,流速2μL·min-1。平衡30min后進(jìn)行鼻腔給藥。于給藥后每隔15min收集一次透析液30μL,采用自動(dòng)恒溫(-4℃)冷凍收集器連續(xù)收集5h,置于收集樣品的專用小試管中,并置于4℃冰箱中保存,待測(cè)放射性強(qiáng)度(cpm),并折算成NT實(shí)際濃度。利用公式(2)校正,得到各時(shí)間點(diǎn)NT實(shí)際濃度,并用藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算各參數(shù)。NT實(shí)際濃度=NT測(cè)定值回收率(2)3結(jié)果3.1zeta電位所得納米粒大小均一、表面光滑,平均粒徑為106.8nm,Zeta電位-28.40mV,包封率為70.60%。制備得到的凍干品每克中冰片含量為14.60mg,薄荷腦含量為50.67mg。3.2平均體內(nèi)回收率腦微透析探針插入PAG部位,125I-NT的平均體內(nèi)回收率(丟失)為12.6%(SD±1.2%)。NT的體內(nèi)回收率(丟失)用于透析部位PAG的透析液中的實(shí)際藥物濃度的校正。3.3藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分析不同吸收促進(jìn)劑NT納米粒經(jīng)大鼠鼻腔給藥后平均腦內(nèi)藥物濃度-時(shí)間曲線見圖1,藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)用3P97軟件進(jìn)行擬合,結(jié)果PAG中NT的動(dòng)力學(xué)過程符合二室模型,藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。由結(jié)果可知,添加中藥吸收促進(jìn)劑(低共熔物、冰片或薄荷)的納米?？娠@著增加NT入腦的程度與速度,而應(yīng)用冰片-薄荷腦低共熔物則顯著優(yōu)于單純應(yīng)用冰片或者薄荷腦。4中藥吸收促進(jìn)劑用量對(duì)合成納米粒和藥物生物利用度的影響實(shí)驗(yàn)室前期工作成果表明,單獨(dú)使用NT鼻腔給藥后,NT幾乎不能入腦吸收,而將NT制成納米制劑,實(shí)驗(yàn)結(jié)果NT-NPs-Ⅱ能使藥物透過血腦屏障入腦,并具有一定地緩釋作用。但是NT吸收量較少,生物利用度較低。本課題采用中藥吸收促進(jìn)劑修飾納米粒進(jìn)行鼻腔給藥,不6932525間。其原因可能是BO/