自噬自噬的分子機(jī)制與病理生理意義

自噬自噬的分子機(jī)制與病理生理意義

自動(dòng)嘲弄是細(xì)胞通過溶解酶體分解自身損害的過程。這是真核細(xì)胞的獨(dú)特生命現(xiàn)象。自噬現(xiàn)象最早是Ashford和Porten于1962年用電子顯微鏡在人的肝細(xì)胞中觀察到。但直到近10年,隨著酵母模型的建立和基因技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)自噬分子機(jī)制和形態(tài)特點(diǎn)的了解才逐漸深入,并認(rèn)識(shí)到自噬性細(xì)胞死亡有別于凋亡(Ⅰ型程序性死亡),而被稱為Ⅱ型程序性死亡。1自我約束的概念1.1自噬體的形成自噬的發(fā)生過程大致分為3個(gè)階段:(1)在饑餓、氧化應(yīng)激損傷等情況下,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等來源的自噬體膜脫落形成杯狀分隔膜,包繞在被降解物(部分的胞漿和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì))周圍;(2)分隔膜逐漸延伸,將要被降解的胞漿成分完全包繞形成自噬體(autophagosome);(3)自噬體通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體,與之融合形成自噬溶酶體并降解其內(nèi)成分,自噬體膜脫落再循環(huán)利用。自噬體直徑一般為300~900nm,平均500nm。自噬體形成之初,胞漿與核質(zhì)變暗,但胞核結(jié)構(gòu)無明顯變化,可見線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹,高爾基體增大,胞膜特化結(jié)構(gòu)如微絨毛、連接復(fù)合物等消失,胞膜發(fā)泡并出現(xiàn)內(nèi)陷。自噬后期,自噬體的體積和數(shù)量都有所增加,其內(nèi)常充滿髓磷脂或液體,出現(xiàn)灰白色成分,少數(shù)可見核固縮,這些特征可作為形態(tài)學(xué)檢查的依據(jù)。1.2-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)體的巨自噬根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體途徑的不同可將自噬分為3種類型:微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediatedautophagy,CMA)。巨自噬即通常所指的自噬,胞質(zhì)被來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非核糖體區(qū)域、高爾基體等脫落的雙層膜所包繞。在微自噬中也發(fā)生相同的包繞過程,但包繞底物的是自身發(fā)生內(nèi)陷的溶酶體膜。CMA為胞漿內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中,被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子,所以CMA降解途徑在清除蛋白質(zhì)時(shí)有選擇性,而前兩者無明顯的選擇性。1.3自噬在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中的作用自噬過程經(jīng)歷的時(shí)間相對(duì)較短(T1/2為8min),說明自噬是細(xì)胞對(duì)于環(huán)境變化的有效反應(yīng),對(duì)新陳代謝起著舉足輕重的作用:(1)自噬是對(duì)外源性刺激(包括營養(yǎng)缺乏、細(xì)胞密度負(fù)荷、低氧、氧化應(yīng)激、感染等)的適應(yīng)性反應(yīng),其降解產(chǎn)物氨基酸、核苷酸、游離脂肪酸等可供物質(zhì)能量循環(huán);(2)自噬作為細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制,可調(diào)控長壽命蛋白、過氧化物體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的更新;(3)自噬參與一定的組織特異性融合;(4)自噬既可以作為一種防御機(jī)制清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器、代謝產(chǎn)物,進(jìn)行亞細(xì)胞水平上的重構(gòu),保護(hù)受損的細(xì)胞,同時(shí)它作為一種細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞主動(dòng)性死亡。2自我攻擊的分子機(jī)制2.1超基性體層面的atg蛋白在細(xì)胞自噬體無法內(nèi)在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)了4組酵母自噬相關(guān)基因atg(autophagyrelatedgene),它們的編碼蛋白在自噬的誘導(dǎo)、產(chǎn)生、成熟、再循環(huán)中起重要作用。(1)上游自噬信號(hào)被激活,Atg1-Atg11-Atg17-Atg20-Atg24復(fù)合物和Atg8-Atg13復(fù)合物因Atg1和Atg13的去磷酸化而結(jié)合促進(jìn)下游自噬信號(hào)激活。(2)Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3k)復(fù)合物(Atg6-Atg14-Vps15-ClassⅢPI3k)磷酸化磷脂酰肌醇(PI)為3-磷脂酰肌醇(PI3P),募集胞漿中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白質(zhì),用于自噬體膜的形成。(3)Atg8和Atg12泛素樣蛋白系統(tǒng):Atg8的修飾過程對(duì)自噬體的形成必不可少。它被半胱氨酸酶Atg4/Atg2切割后具備形成硫酯鍵的活性,在E1樣酶Atg7、E2樣酶Atg3的共同作用下與磷脂酰乙醇胺PE連接。Atg12系統(tǒng)直接參與自噬體前體的形成,Atg12首先由E1樣酶Atg7活化,之后轉(zhuǎn)運(yùn)至E2樣酶Atg10,最后與Atg5結(jié)合,形成自噬體前體,Atg12-Atg5與Atg16形成六聚體復(fù)合物(Atg12-Atg5-Atg16)2,一方面促進(jìn)了自噬泡的伸展擴(kuò)張,使之由開始的小囊泡樣、杯樣結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)展為半環(huán)狀、環(huán)狀結(jié)構(gòu)。Atg5復(fù)合物與自噬體膜的結(jié)合還促進(jìn)了Atg8-PE向自噬泡的募集,最后孤立的自噬體前體膜連接形成完整的自噬體。(4)Atg2-Atg9-Atg18復(fù)合物參與其他ATG蛋白從成熟自噬體上脫離和循環(huán)利用。近些年在人及其他高等動(dòng)物中克隆出部分atg的同源基因及編碼蛋白。Atg8在人類存在3種同源體:GABARAP(γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白)、GATE-16(高爾基體相關(guān)ATP酶增強(qiáng)子)和LC3(微管相關(guān)蛋白3)。LC3被Atg4的同源體hATG4B加工形成LC3-I,LC3-I的PE修飾形式LC3-Ⅱ位于自噬體的內(nèi)膜和外膜,其與熒光蛋白形成融合蛋白后,很容易在細(xì)胞內(nèi)定位,所以LC3通常被用作哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自噬體膜的標(biāo)記蛋白。在體外培養(yǎng)的鼠胚胎干細(xì)胞中,Atg5的同源體參與自噬體的形成,Atg5和Atg12在人類的同源體hATG5和hATG12也相互連接。其他的酵母Atg蛋白在人類的同源體見表1。還有研究發(fā)現(xiàn)反義Atg6,Atg5和Atg10等能明顯抑制細(xì)胞自噬體的形成,降低胞質(zhì)空泡化程度低。而LAMP1和LAMP2編碼溶酶體相關(guān)膜蛋白,用LAMP2siRNA處理細(xì)胞,空泡化程度沒有降低反而增高,LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加,幸存的小鼠出現(xiàn)多組織廣泛的自噬性空泡,這是因?yàn)樾纬傻淖允审w沒有與溶酶體融合降解,導(dǎo)致自噬體大量積聚。2.2自我約束的抑制機(jī)制2.2.1tsc1/2蛋白信號(hào)抑制機(jī)制mTOR作為氨基酸、ATP、生長因子、胰島素等的感受器,對(duì)細(xì)胞生長具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,發(fā)揮“門衛(wèi)(gatekeeper)”作用。mTOR的上下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑較為復(fù)雜,mTOR上游通路:胰島素、生長因子(胰島素樣生長因子,血小板源性生長因子和表皮生長因子等)結(jié)合于跨膜胰島素受體或酪氨酸激酶受體(IR,RTK)后,激活Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅠPI3K),使PIP被磷酸化為PIP3,PIP3結(jié)合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物TSC1/2蛋白位于ClassⅠPI3K/PKB途徑的下游,同時(shí)也能整合胰島素、生長因子、能量代謝等信號(hào),抑制mTOR的激酶活性,對(duì)自噬發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。TSC2蛋白能夠負(fù)調(diào)節(jié)一種小分子鳥苷三磷酸酶Rheb,使具有mTOR結(jié)合活性的GTP-Rheb轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP-Rheb。TSC2被AKT磷酸化后,這種負(fù)調(diào)節(jié)作用減弱,mTOR活性增強(qiáng)。而AMPK(AMP活化蛋白激酶)磷酸化TSC2后起相反作用。在細(xì)胞氧化應(yīng)激、能量不足時(shí),AMP/ATP比值增加,AMPK活性增強(qiáng),磷酸化激活TSC1/2蛋白,從而抑制mTOR、促進(jìn)自噬形成。mTOR下游通路:mTOR活性抑制時(shí),促進(jìn)自噬體形成,在酵母中是通過Atg1和Atg13去磷酸化而促進(jìn)下游自噬信號(hào),在人類中的機(jī)制尚不明了。mTOR活性增強(qiáng)時(shí),通過磷酸化S6K1激活之,進(jìn)而磷酸化核糖體蛋白S6(p70S6)來促進(jìn)mRNA翻譯,同時(shí)促使核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的黏附而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜脫落形成自噬體膜。mTOR同時(shí)也磷酸化4E-BPs并抑制其活性,解除了對(duì)真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子eIF4E的抑制。有研究發(fā)現(xiàn)氨基酸依賴的mTOR信號(hào)導(dǎo)致胰島素依賴的mTOR信號(hào)被抑制,這是因?yàn)镾6K1還可磷酸化IRS1,導(dǎo)致其與ClassⅠPI3K結(jié)合減弱,抑制了ClassⅠPI3K的下游信號(hào),這可能是在氨基酸豐富條件下避免mTOR信號(hào)過分激活的一種反饋機(jī)制。所以在氨基酸豐富時(shí),mTOR信號(hào)激活,自噬被抑制,S6K1活性增強(qiáng),增加了mRNA翻譯、蛋白質(zhì)合成,氨基酸缺乏時(shí),原料減少,蛋白質(zhì)合成減少,同時(shí)mTOR信號(hào)被抑制,自噬增強(qiáng),S6K1活性減弱,負(fù)反饋IRS/ClassⅠPI3K的作用減弱,也增強(qiáng)了自噬。2.2.2抗凋亡因子tg6對(duì)乳腺癌自噬的影響經(jīng)典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)通過抑制ClassⅢPI3K(hVps30)的活性抑制自噬形成,siRNA導(dǎo)致ClassⅢPI3K活性的下降大大減少了細(xì)胞中自噬的發(fā)生,因?yàn)镃lassⅠPI3K的產(chǎn)物PI3P是自噬抑制信號(hào),ClassⅢPI3K的產(chǎn)物PIP為激活信號(hào),另外抑癌基因PTEN可以水解PI3P,所以它也是一個(gè)促自噬因子。此外,Atg6的哺乳動(dòng)物同源體beclin1和抑癌基因UVRAG作為自噬正調(diào)控子,抗凋亡因子bcl-2作為自噬負(fù)調(diào)控子共同參與組成ClassⅢPI3復(fù)合物調(diào)控自噬。GTP結(jié)合的G蛋白亞基Gαi3是自噬的抑制因子,而GDP結(jié)合的Gαi3蛋白則是自噬的活化因子。GAIP(Galphainteractingprotein)作為RGS(regulatorsofG-proteinsignaling)家族成員之一,通過Gαi3蛋白加速GTP的水解,促進(jìn)自噬的發(fā)生。另外死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associatedproteinkinase,DAPK)和DAPK相關(guān)蛋白激酶(DAPK-relatedproteinkinase-1,DRP-1)在腫瘤細(xì)胞中也可誘導(dǎo)自噬。在用三苯氧胺治療的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),DRP-1的低表達(dá)可以降低饑餓水平和自噬。在宮頸癌HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),DAPK的低表達(dá)可以降低INF-γ誘導(dǎo)的自噬。還有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰島素,氨基酸等通過激活p38MAPK(p38α)而抑制自噬,且不依賴于mTOR途徑。PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium途徑也存在于自噬過程錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,但其機(jī)制還不甚清楚。3構(gòu)重建、生長分化自噬既廣泛存在于正常的生理過程中,如清除細(xì)胞廢物、結(jié)構(gòu)重建、生長分化等,又是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境的一種防御機(jī)制,如對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏、電離輻射,同時(shí)還參與多種疾病的病理過程,無論是自噬過度還是自噬不足都可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。3.1在精神病理方面的應(yīng)用已證實(shí)自噬與癌前病變、癌細(xì)胞增殖及其抑制關(guān)系密切。Beclin-l基因與酵母自噬基因Atg6/Vps30同源。40%~75%的人類偶發(fā)性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞中,beclin-l呈單等位基因缺失。轉(zhuǎn)染beclin-l的MCF-7細(xì)胞自噬增強(qiáng)、細(xì)胞生長、克隆形成及乳腺腫瘤形成受抑制。另有研究證明,beclin-l等位基因敲除的小鼠自發(fā)性惡變的概率增加,提示beclin-1是哺乳動(dòng)物的抑癌基因,beclin-1的過度表達(dá)抑制腫瘤是通過增強(qiáng)自噬實(shí)現(xiàn)的。如:他莫昔芬可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7發(fā)生自噬,由神經(jīng)酰胺介導(dǎo)上調(diào)beclin-1表達(dá)發(fā)揮作用。三氧化二砷緩解早幼粒細(xì)胞性白血病和多發(fā)性骨髓瘤的病情也是通過增加beclin-1的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡。但是有些腫瘤細(xì)胞保持了較高的自噬活性,如肺癌細(xì)胞及人宮頸癌HeLa細(xì)胞等。研究表明,持續(xù)缺乏血清或氨基酸約3h,HeLa細(xì)胞中的自噬部分從4%上升到37%。這些腫瘤細(xì)胞所具有的高自噬活性對(duì)腫瘤細(xì)胞在惡劣環(huán)境中的生存起到了一定的保護(hù)作用,也可能使一些抗腫瘤藥物的作用減弱。目前認(rèn)為自噬對(duì)于腫瘤細(xì)胞存在雙向效應(yīng)。因此,可能是腫瘤發(fā)展不同階段、組織類型、細(xì)胞分化狀態(tài)、周圍環(huán)境以及特定的基因特征和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑共同影響著自噬的活性和結(jié)果,一些自噬因大分子物質(zhì)循環(huán)和有害物質(zhì)的隔離使腫瘤細(xì)胞生存,一些自噬超過某一閾值大量降解蛋白質(zhì)與細(xì)胞器導(dǎo)致自噬性死亡。3.2內(nèi)毒與其他疾病之間的關(guān)系3.2.1抗原加工作用細(xì)菌可以被胞質(zhì)內(nèi)的自噬體內(nèi)化,并被溶酶體降解從而減少細(xì)胞內(nèi)具有復(fù)制能力的病原體。還有研究發(fā)現(xiàn)自噬消化胞質(zhì)蛋白能夠促進(jìn)MHCII抗原加工過程。IFN-γ能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞發(fā)生自噬,在自噬協(xié)同下處理MHCII抗原加工和呈遞。故自噬可以被認(rèn)為是一種獲得性免疫機(jī)制,參與清除入侵的病原體。然而,還有一些細(xì)菌將自己隱蔽在自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)內(nèi),宿主的防御機(jī)制對(duì)其施加了強(qiáng)大的進(jìn)化壓力從而使其獲得相應(yīng)的方法對(duì)抗宿主的清除機(jī)制而存活。3.2.2synuclein蛋白在森病中的表達(dá)自噬參與異常蛋白質(zhì)的降解,有利于防止神經(jīng)元內(nèi)異常蛋白質(zhì)的蓄積,如帕金森病中的Synuclein蛋白的蓄積與自噬能力下降有關(guān)。然而自噬作用過度活躍會(huì)造成線粒體功能障礙,如享延頓氏舞蹈病與享延頓蛋白(Htt)的蓄積,Htt激發(fā)自噬伴隨著細(xì)胞凋亡蛋白酶的激活和大量線粒體的受損。3.2.3對(duì)原理的認(rèn)識(shí)幾乎所有的衰老組織都存在溶酶體系統(tǒng)形態(tài)學(xué)和酶學(xué)的改變。隨著年齡的增長,細(xì)胞內(nèi)自噬作用開始減弱,導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境和自身防御反應(yīng)的能力降低,損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及大量氧自由基等活性氧化合物不能有效地被清除,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化,加速細(xì)胞老化。維持正常的自噬功能與長壽相關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明,生命早期即