實驗總結(jié)-細胞培養(yǎng)方法

一、培養(yǎng)細胞常用配置培養(yǎng)基的配置：根底培養(yǎng)基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml凍存液的配置：10%DMSO+90%胎牛血清依次比例酌量配置。超凈工作臺常規(guī)配置移液器1套〔2.5μl、20μl、200μl、1ml〕，酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規(guī)耗材：培養(yǎng)瓶〔50㎝2〕，定量移液管〔5ml、10ml〕，槍頭〔1ml、200μl、10μl〕，培養(yǎng)皿，6/24/48/96孔板，醫(yī)用脫脂棉球，凍存管所需試劑：培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關(guān)閉工作臺翻開紫外燈照射30min后開場實驗操作。培養(yǎng)基及胰酶恢復(fù)常溫后使用，可37℃水浴5-10min二、細胞復(fù)步驟：1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液〔DMEM〕，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。超凈臺準備一支15ml離心管備用。3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢參加4ml培養(yǎng)液，離心〔1000r/min，5min〕。6.取出2個培養(yǎng)皿并做好標記〔復(fù)日期等〕，提前參加5-10ml培養(yǎng)液；離心完畢后用1ml培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞后分別參加培養(yǎng)皿。7.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。8.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)考前須知：1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜〔DMSO〕對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min使凍存液完全融化。如果復(fù)溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜〔DMSO〕最好選擇進口產(chǎn)品。3.離心前須參加少量培養(yǎng)液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意參加少量培養(yǎng)液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進展培養(yǎng)，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜〔DMSO〕，DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養(yǎng)液6.復(fù)細胞分裝的問題：復(fù)1管細胞一般可分裝到2-3只培養(yǎng)皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。7.加培養(yǎng)基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養(yǎng)基的太少，則DMSO的濃度就會比擬大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候?qū)σ话慵毎麤]有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話則加10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液參加保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復(fù)時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜〔DMSO〕和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。三、培養(yǎng)液的更換1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液〔DMEM〕，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基瓶吸取5-10ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。7.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進展細胞的傳代。四、細胞傳代1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。4.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁參加培養(yǎng)皿。5.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min〔消化時間根據(jù)細胞不同時間不同〕，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。〔假設(shè)看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設(shè)看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化〕。用移液器將胰酶吸凈。6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。7.取1或2個新的培養(yǎng)皿，然后將細胞培養(yǎng)基均勻的分到2或3個培養(yǎng)瓶〔注意原來傳代時使用的培養(yǎng)瓶可繼續(xù)傳代使用〕，進展1傳2或1傳3的培養(yǎng)。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養(yǎng)基皿吸取5-10ml培養(yǎng)基懸空移入每個培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。9.將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。10.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。注意整個培養(yǎng)箱底托盤一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進展細胞的傳代或保株。五、細胞株的保存原理：細胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反響。如細胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，局部蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細胞部空間構(gòu)造紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞構(gòu)造成分造成破壞，線粒體腫脹，功能喪失，并造成能量代障礙。胞膜上的類脂蛋白復(fù)合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞容物喪失。如果細胞冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術(shù)的關(guān)鍵是盡可能地減少細胞水分，減少細胞冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞的水分滲出細胞外，減少胞形成冰結(jié)晶的時機，從而減少冰晶對細胞的損傷。實驗步驟：選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，參加少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。參加凍存管中，再參加1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。1.紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。2.培養(yǎng)液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清〔解凍〕，梯度降溫盒恢復(fù)常溫，恒溫水浴箱37℃預(yù)熱20min，備用。3.將所需的培養(yǎng)基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。4.將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養(yǎng)瓶。5.將培養(yǎng)皿蓋口朝上放在架子上，將培養(yǎng)皿的培養(yǎng)液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁參加培養(yǎng)皿。6.將培養(yǎng)皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min〔消化時間根據(jù)細胞不同時間不同〕，對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。〔假設(shè)看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；假設(shè)看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續(xù)消化〕。用移液器將胰酶吸凈。6.吸取1ml培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿，并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài)。7.將懸浮細胞吸入15ml離心管，參加4ml培養(yǎng)基離心1000r/min，5min8.預(yù)先配制凍存液：10%DMSO+90%胎牛血清。按需要配置一定數(shù)量備用9.棄去培養(yǎng)基，用凍存液進展重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。10.將培養(yǎng)基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。8.將凍存管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌長期保存?；蛑苯臃湃胩荻冉禍睾?，放入-80℃冰箱過夜后最后存放于液氮罐?！蔡荻冉禍睾袨榧状?，使用5次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復(fù)常溫〕六、細胞轉(zhuǎn)染RNA干擾〔RNAinterference,RNAi〕:是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA〔double-strandedRNA，dsRNA〕誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊?，主要有轉(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常錄;PTGS是啟動了細胞質(zhì)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)基因會同時導(dǎo)致TGS和PTGS。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，〔長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性〕所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組，并利用宿主細胞進展轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反響。作用機制其胞質(zhì)中的核酸切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和構(gòu)造的小片段RNA〔大約21～23bp〕，即siRNA。siRNA在細胞RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體一些酶〔包括切酶、外切酶、解旋酶等〕結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物〔RNA-inducedsilencingple*，RISC)。RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進展特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反響。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP〕作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。RNAi發(fā)生于除原核生物以外的所有真核生物細胞。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導(dǎo)致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應(yīng)基因寂靜。所以正常機體各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染原理：脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質(zhì)體模擬生物膜，研究膜的構(gòu)造及功能，從而發(fā)現(xiàn)了膜的融合及吞作用，因而可用作外源物質(zhì)進入細胞的載體陽離子脂質(zhì)體外表帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人，形成DNA一脂復(fù)合體，也能被外表帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小局部DNA能從包涵體釋放，并進入細胞質(zhì)中，再進一步進入核轉(zhuǎn)錄、表達DNA轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時細胞到達90-95%每孔。轉(zhuǎn)染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。A液：DNA5ug參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻。B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。B液參加A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字穿插搖晃。孵箱37℃培養(yǎng)48h〔轉(zhuǎn)染時間待定〕。第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。同時設(shè)立細胞對照組，空白轉(zhuǎn)染組。siRNA轉(zhuǎn)染步驟轉(zhuǎn)染前一天接種細胞于6孔板〔40*104〕，2ml無抗生素培養(yǎng)基每孔，第二天轉(zhuǎn)染時細胞到達50-60%每孔。轉(zhuǎn)染前半小時換Opti-MEM無血清培養(yǎng)基1.5ml。A液：siRNA5ul〔共100pmol〕參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻?！瞫iRNA按照說明書稀釋〕B液：脂質(zhì)體〔RNAima*〕使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體10ul參加245ulOpti-MEM無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜止5min。B液參加A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字穿插搖晃。孵箱37℃培養(yǎng)48h〔轉(zhuǎn)染時間待定〕。第二天看細胞狀態(tài)來決定是否換液。同時設(shè)立細胞對照組，空白轉(zhuǎn)染組。使用RNAiMA*和AGScell用于siRNA在6孔板上進展轉(zhuǎn)染實驗提前配制